МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОДВИГАЮЩИХСЯ ФОРМ

Для выделения и подсчета инфузорий и жгутиконосцев исполь­зуют широко применяемый в микробиологии метод предельных разведений навески почвы (по Cutler, 1920) жидкой питательной средой (сенной настой с почвенной вытяжкой в соотношении 1 : : 1) и его модификации (Николюк, Гельцер, 1972).

Навеску почвы (Юг) необходимо тщательно подготовить для анализа. Взбалтывания недостаточно для сухих почвенных проб, так как при этом не разрушаются почвенные агрегаты и клетки микроорганизмов не десорбируются с почвенных частиц. Поэто­му рекомендуется тщательное растирание почвы, увлажненной до пастообразного состояния жидкой питательной средой (Звя­гинцев, 1966).

Обычно делают 6 разведений от 1 : 10 до 1 : 1 000 ООО. Для их приготовления необходима стерильная колба с 90 мл жидкой пи­тательной среды (небольшое ее количество берут для доведения почвы до пастообразного состояния) и 15 пробирок (для 5 раз­ведений в трех повторностях) с 9 мл питательной среды в каж­дой. В колбу с 90 мл питательной среды помещают подготовлен­ный почвенный образец (первое разведение—1 : 10), взбалты-

57

вают в течение 10 мин., на 30 сек. оставляют для осаждения гру­бых частиц, из полученной почвенной суспензии делают второе разведение в трех повторностях: стерильной пипеткой берут 1 мл почвенной суспензии и переносят в пробирку с 9 мл жидкой питательной среды (разведение 1 : 100). Затем из этой пробирки стерильной пипеткой переносят 1 мл в следующую пробирку с 9 мл. Всего таким образом делают 5 разведений — от 1 : 100 до 1 : 1 000 000. Сосуды надписывают и помещают в термостат при 22—24° или содержат при комнатной температуре. Микроскопи­ческий контроль культур и определение проводят с 3—4-х по 30-е сутки инкубации несколько раз, так как инцистирование и экс- цистирование разных видов происходят в разные сроки и одни формы простейших сменяют другие. Для сгущения суспензии и удобства обнаружения организмов в культуре 1—2 мл ее цент­рифугируют в течение 2—3 мин.

Количество простейших (по таксономическим группам или по отдельным видам) определяют по таблице (табл. 1), предло­женной Мак Крэди для подсчета микроорганизмов (Me Crady, 1918).

Таблица 1

Определение количества простейших в 1 г почвы (3 повторности;'с сокраще­ниями по Мак Кради)

Обнаруживая простейших в определенных разведениях и их повторностях, составляют числовую характеристику, состоящую из трех цифр: первая соответствует числу повторностей — обыч­но 3.

SS

нии впервые во всех трех пробирках появились представители данной группы — например, инфузорий. Следующие две цифры числовой характеристики соответствуют числу повторностей, в которых развилась культура в двух разведениях, следующих после отмеченного. В табл. 1 находим вероятное число, соответ­ствующее полученной числовой характеристике. Для получения количества простейших в 1 г почвы это вероятное число умножа­ем на знаменатель того разведения, где впервые во всех трёх повторностях появилась данная культура. Поясним сказанное на примере:

Разведения: 1:10 1:100 1:1000 1:10 000 1:100 000 1:1000 000

ЧислсЛпробирок с раз- 3 3 0 1 0 0

вившейся культурой

простейших

Число повторностей — 3 (первая цифра характеристики), при этом впервые (начиная с разведения 1 : 1 000 000) во всех трех пробирках культура данного организма развилась в разведении 1 : 100. Следующими цифрами характеристики будут: ноль (в разведении 1 : 1000 вообще не развились клетки данных простей­ших) и единица (в разведении 1 : 10 000 они развились в одной пробирке). Получаем числовую характеристику'301. В таблице ей соответствует вероятное число 4,0, которое нужно умножить на 100, так как впервые именно в разведении 1 : 100 было от­мечено развитие культуры во всех пробирках. Следовательно, количество организмов данной группы в 1 г почвы — 400. Для подсчета общего числа простейших в 1 г почвы числа, получен­ные для каждой группы, суммируют. При анализе свежей почвы учитывают процент влажности. _

Для видового определения необходимо выявление органойдов клетки и её цитологических структур. Для обнаружения этих де­талей строения применяют прижизненное окрашивание водными растворами метиленового синего, метиленового зеленого, нейт­рального красного и других красителей. Работу ресничек, жгу­тиков и пищеварительных вакуолей наблюдают в слабых раз­ведениях туши. Фиксированные препараты изготовляют обра­боткой в течение 1—2 мин.

59

вых клеток или с препаратов с помощью рисовального аппара­та при 900—1500-кратном увеличении.

Используют также метод подсчета простейших, при котором делают последовательный ряд десятичных разведений навески почвы стерильной водопроводной водой. Каплю из каждого раз­ведения высевают в пробирки с питательной средой (сенной нас­той с почвенной вытяжкой). Посевы культивируют и обрабаты­вают по общепринятой методике, при этом количество простей­ших в 1 г почвы принимают равным знаменателю того разведе­ния, в посевах из которых развились культуры простейших (Николюк, 1956).

Оригинальную модификацию метода разведений для подсче­та бактериальной и протозойной популяций в почве разработал и описал Дарбишайр с соавторами (Darbyshire et al., 1974). Обзор количественных методов учета активных почвенных про­стейших, разработанных советскими протистологами приведен в работе М. С. Гилярова (Gilarov, 1957), доложенной на спе­циальном международном симпозиуме в Генте.

При работе с почвенными простейшими существенным явля­ется не только определение общего числа организмов, но и вы­явление соотношения активных и инцистированных форм. Кат­лер (Cutler, 1920) предложил обрабатывать параллельную на­веску почвы 2%-ной НС1 в течение нескольких часов. При этом активные формы погибают, цисты же сохраняют жизнедеятель­ность. После обработки НС1 подсчитывают количество цист, при­меняя обычную методику. О количестве активных форм в почве дает представление разность между подсчетами по первой и вто­рой навескам. Однако действие НС1, видимо, не столь однознач­но, так как иногда после обработки кислотой количество развив­шихся организмов значительно увеличивается.

Для уничтожения живых клеток используют также нагрева­ние почвенной суспензии до 60—70° (Северцова, 1924).