ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (общие сведения)
Во второй половине 80-х годов в практику судебно-медицинской экспертизы вошли методы молекулярной генетики, позволяющие использовать для целей идентификации личности данные о строении молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
Опыт применения методов исследования ДНК в практике Экспертно-криминалистического центра Министерства внутренних дел России обобщен в материалах, подготовленных авторами ранее [1 -4]. Настоящие методические рекомендации посвящены вопросам типирования гипервариабельных локусов ДНК посредством цепной полимеразной реакции.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой циклический ферментативный процесс, осуществляемый при участии ДНК-полимеразы. ПЦР обеспечивает синтез заданной последовательности, которая накапливается в экспоненциальной зависимости, благодаря чему ее количество к концу реакции многократно увеличивается. Границы амплифицируемого участка определяются олигонуклеотидными праймерами, комплементарными З'-концу интересующей последовательности.
Цикл амплификации состоит из трех фаз. В первой фазе под действием высокой температуры происходит денатурация молекул ДНК - разъединение каждой из них на две комплементарные цепи. Во второй фазе - отжига праймеров - внесенные в реакционную смесь праймеры находят на молекуле ДНК комплементарные им последовательности и соединяются с ними. Отжиг происходит при более низкой температуре, чем денатурация, соответствующей для данных праймеров. В третьей фазе - достраивания - происходит синтез комплементарных матрице последовательностей ДНК из находящихся в смеси нуклеотидов. В результате к концу цикла количество цепей двухцепочечной ДНК удваивается. Следующий цикл начинается также с температурной денатурации ДНК, при этом матрицей служат не только те молекулы ДНК, которые находились в пробе исходно, но и те цепи, которые были синтезированы в предыдущем цикле.
Теоретически, к концу 30-го цикла амплификации на основе одной молекулы ДНК синтезируется 10 копий интересующей последовательности. Это, по сути, делает возможным анализ генетического материала одной клетки. Хотя на практике и существует ряд моментов, делающих анализ столь малых количеств ДНК проблематичным, возможность идентификации с помощью ПЦР микрообъектов является очевидной.Полиморфизм ДНК может быть разделен на две категории:
- полиморфизм последовательностей, свойственный генам комплекса HLA, локусам LDLR, GYPA, HBGG и т. д.;
- полиморфизм длины последовательностей, характерный для локусов, аллельные варианты которых содержат вариабельное количество тандемных повторов (variable number tandem repeats - VNTR). В обоих случаях для накопления фрагментов ДНК, содержащих полиморфный участок, может быть применена ПЦР. После этого для различения аллельных вариантов используются разные подходы.
Наиболее простым способом детектирования полиморфизма последовательностей является использование аллель-специфичных зондов. В определенных, специально подобранных условиях такие зонды будут гибридизоваться только с теми последовательностями, которым они полностью комплементарны. Для того чтобы создать такие зонды, вначале должна быть определена последовательность ДНК всех обычно встречающихся аллельных вариантов. Когда это установлено, могут быть получены аллель-специфичные зонды, которые будут детектировать эти аллели посредством дифференциальной гибридизации. Есть два соответствующих подхода: при одном из них продукт ПЦР наносят на фильтры и исследуют аллель-специфичными
зондами; при другом - зонды сами иммобилизуют на одном фильтре, используя их для захвата комплементарного ПЦР-продукта. В обоих случаях продукты гибридизации детектируются образованием цветного преципитата. Анализ полиморфизма последовательностей ДНК осуществляется также путем непосредственной расшифровки изучаемых последовательностей.
Вариации аллелей по длине детектируют путем фракционирования ПЦР-продуктов по размерам последовательностей в аналитическом геле. Эти продукты получают, используя праймеры, которые фланкируют повторяющиеся участки локуса. В условиях, обеспечивающих специфичность реакции, размер продуктов отражает число тандемных повторов, содержащихся в пределах каждого аллеля. Детектировать локусы можно также посредством блоттинга и гибридизации с зондами, специфичными для тандемных повторов.