ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ КАНАЛЬЦЕВ ТУЛОВИЩНОЙ ПОЧКИ КОСТИСТЫХ РЫБ И ИХ ВЗАИМОСВЯЗЬ С ВЫПОЛНЯЕМЫМИ ФУНКЦИЯМИ

Е. А. Назарова

Учреждение Российской академии наук Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН, п. Борок., Ярославская обл., Россия

e-mail: katarinum@mail.ru

Введение

Мезонефрос рыб - это уникальный многофункциональный орган, выполняющий выведение продуктов обмена, поддерживающий гомеостаз, осуществляющий защитные функции организма [8,10].

Материалы и методы исследования

Объектом исследования послужили особи 7 видов карпообразных: усатый голец (Barbatula barbatula (L.)), серебряный карась (Carassius auratus (L.)), лещ (Abramis brama (L.)), линь (Tinca tinca (L.)), плотва (Rutilus rutilus (L.)), синец (Abramis ballerus (L.)), обыкновенная щиповка (Cobitis taenia L.) и 5 видов окунеобразных рыб: пресноводных - волжский судак, берш (Stizostedion volgense (Gmelin)), обыкновенный судак (Stizostedion lucioperca (L.)), речной окунь (Perca fluviatilis L.) и мор­ских - средиземноморская ставрида (Trachurus mediterraneus (Staindachner)), морской карась (Diplodus annularis (L.)). Рыб отлавливали тралом, неводом и сачком в летне - осенний период 2005 - 2006 гг. в Рыбинском водохранилище, реках Ильд и Сутка и Севастопольской бухте Черного моря.

Кусочки туловищной почки объемом 1 мм³ подвергали двойной фиксации в 2,5% глютаральде­гиде на 0,1М фосфатном буфере и 1% четырехокиси осмия (OsO4), на том же буфере. Затем материал промывали в промывочном буфере, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации. Затем про­питывали в смеси ацетона и смолы, в различных соотношениях. Завершали данный процесс пропит­кой ткани чистой смолой и полимеризацией блоков [9]. Ультратонкие срезы толщиной 200-300 А приготавливали на микротоме LKB 8800, контрастировали 0,2% водными растворами уранилацетата и цитрата свинца, и просматривали под трансмиссионным электронным микроскопом JEM 100C.

Результаты и обсуждение

Электронная микроскопия позволила детально изучить тонкую структуру основных отделов нефрона. Стенка нефрона была построена из однослойного эпителия, клетки которого (в зависимо­сти от выполняемой функции) были различны в разных отделах нефрона.

Эпителиоциты проксимального участка канальца. Анализ ультраструктуры эпителиаль­ных клеток, выстилающих этот участок канальца, показал, что эпителиоциты можно было разде­лить на 2 типа. Эпителиоциты I типа образовывали начало проксимального канальца. Размеры клеток колебались незначительно, преобладали эпителиоциты длиной 13-17 мкм. Самые крупные клетки были отмечены у судака (18,84х14,32 мкм), эпителиоциты наименьших размеров у морского карася (11,69х9,32 мкм). Это были вытянутые, пирамидальной формы клетки, плотно прилегающие друг к другу. Ядра клеток были округлой формы, располагались в базальной части клеток, имели 1­2 ядрышка. Гетерохроматина мало, большая часть его располагалась вдоль ядерной мембраны, ме­жду ядерными порами. Зернистая цитоплазма содержала большое количество митохондрий, кото­рые у большинства видов в базальной части клетки располагались строго вдоль ее оси. Менее упо­рядочено митохондрии лежали в апикальной части клеток. Следует отметить, что у морских видов рыб количество митохондрий было больше, чем у пресноводных, этот показатель в некоторых слу­чаях достигал разницы в 2-6 раз.

значений она достигала у судака (7,60мкм), наименьших - у плотвы (1,84 мкм). Данная зона харак­теризовалась наличием тубуло-везикулярной системой. У всех изученных видов рыб тубуло-вези- кулярная система была образована большим числом микропузырьков и короткими сегментами изо­гнутых тубул без анастомозов, между которыми локализовались микрофиламенты. Щеточная каем­ка была наиболее высокая для этого типа эпителиоцитов. Она состояла из большого числа микро­ресничек и микроворсинок, обращенных в просвет канальца. В эпителиоцитах I типа, всех рассмот­ренных в нашей работе пресноводных видов, толщина микроресничек больше таковой микроворси­нок. Исключение составляли средиземноморская ставрида и морской карась, у этих видов рыб мик­роворсинки были толще микроресничек.

Эпителиоциты II типа - это клетки, которые по плану строения были схожи с клетками I ти­па, но меньшие таковых по высоте. Внутри рассматриваемого типа эпителиоцитов размеры варьи­ровали незначительно, у всех исследованных видов длина колебалась от 9 до 13 мкм. Наименьшие размеры эпителиоцитов были обнаружены в мезонефросе плотвы (8,95х3,60 мкм), наибольшие - в почках синца (13,09х9,58 мкм). У пресноводных видов рыб, ядра эпителиоцитов II типа, как и в клетках I типа, были округлой формы, многие из них располагались в базальной части клеток и только некоторые были смещены к центральной части. У морских видов напротив - большинство располагалось в центральной части клеток. Гетерохроматина мало, большая часть его располага­лась вдоль ядерной мембраны, между ядерными порами. Цитоплазма была менее зернистая, содер­жала большое количество митохондрий, число которых, как и в клетках I типа, превышало в эпите­лиоцитах морских рыб по сравнению с пресноводными. При этом внутри группы пресноводных ви­дов среднее количество митохондрий в клетке составило 20 шт., что превышало таковое значение в эпителиоцитах I типа. Количество митохондрий в клетках щиповки, достигало 33 шт. Длина мито­хондрий у большинства видов колебалась от 0,7 до 1,2 мкм. Лизосомы, по сравнению с клетками I типа, встречались реже. Показательным признаком эпителиоцитов II типа являлось отсутствие в ци­топлазме специфичных гранул. Зона эндоцитоза была развита слабее, по сравнению с клетками I типа. Хотя четко просматривалось наличие тубуло-везикулярной системы. Щеточная каемка была менее высокая по сравнению с клетками I типа. Тем не менее, в ее состав входили как микрорес­нички, так и микроворсинки. Но по сравнению с клетками I типа толщина микроворсинок превос­ходила таковую у всех видов исследуемых рыб.

Эпителиоциты промежуточного участка канала были обнаружены в нефроне синца и су­дака. По своему строению данные эпителиоциты наиболее отличались от рассматриваемых выше типов клеток. Это были самые низкие клетки, в базальной части которых располагались ядра.

Эпителиоциты дистального участка канала. Дистальный каналец формировали высокие и очень широкие у основания клетки. Длина эпителиоцитов большинства исследованных видов варь­ировала от 14 до 18 мкм. Самые высокие эпителиоциты этого участка канала присутствовали в поч­ках линя, самые короткие - в почках гольца. Ядро большинства клеток занимало центральное поло­жение в клетке, иногда было смещено к базальной части. Гетерохроматин был сконцентрирован, как на периферии ядра между ядерными порами, так и диффузно по всей поверхности. Для цито­плазмы было характерно наличие свободных рибосом, хорошо развитого гладкого эндоплазматиче­ского ретикулума, большого количества крупных митохондрий, расположенных по всей длине клетки. Следует отметить, что митохондрии в эпителиоцитах дистального участка канала были крупнее по сравнению с таковыми в проксимальном и промежуточном участках канала у всех ис­следованных видов.

Таким образом, проксимальный участок канала всех исследуемых особей был наиболее диф­ференцированный, здесь можно было выделить 2 типа клеток, отличающихся своей морфологией. Ранее Винниченко Л.Н. показала, что у гольца Alvelinus alpinus L., горбуши Oncorhynchus goruscha Walbaum, карпа Cyprinus carpio L. 3 типа эпителиоцитов, у линя Tinca tinca L. - 2 типа [2]. При этом в качестве критерия разделения эпителиоцитов на типы, автором были выбраны качественные признаки (расположение лизосом и митохондрий в клетке, цвет цитоплазмы, плотность секретор­ных гранул и.т.д.), при этом не учитывались размерные характеристики клеток [2]. В нашей работе мы постарались выявить количественные признаки, по которым четко можно разделить типы эпи­телиоцитов. В результате исследования были выявлены следующие критерии, характеризующие различия клеточных типов внутри одного вида: 1. длина эпителиоцитов (клетки I типа выше тако­вых II типа); 2. длина щеточной каемки (клетки II типа образуют более короткую щеточную каемку, чем клетки I типа); 3. развитие зоны эндоцитоза (протяженность зоны у клеток I типа больше, чем у клеток II типа); 4. наличие секреторных гранул (клетки II типа данные органеллы не образуют).

Различия в размерных характеристиках для выше перечисленных структур у разных видов рыб, скорее всего, были связаны с видовой спецификой. Такие признаки как количество и плот­ность секреторных гранул и лизосом, положение митохондрий, плотность цитоплазмы, различные включения и.т.д. были связаны не с особенностями морфологии различных типов эпителиоцитов, а с функционированием клеток одного типа в определенный момент времени.

Нет сомнений в особенностях функционирования эпителиоцитов различных типов в сегментах канала. Главное отличие эпителиоцитов I типа - наличие секреторных гранул. Это говорит о том, что именно в этом участке канала происходит реабсорбция белка путем пиноцитоза. В гранулах белок пере­варивается, и аминокислоты выделяются в цитоплазму. Функцию секреторных гранул так же связыва­ют с транспортом Na⁺ и Cl^- [1,7,13,15]. Вторым обязательным мембранным компонентом для эпителио­цитов не только I, но и II типа является наличие тубуло-везикулярной системы, которая локализовалась в зоне эндоцитоза. Показано, что через тубуло-везикулярную систему у пресноводных рыб и морских видов транспортируются органические молекулы (в основном полисахариды), а так же различные ио­ны, кроме того, у морских рыб еще и большое количество мочевины [1,7,13]. Аналогично функциони­руют проксимальные канальцы млекопитающих, для которых показана полная реабсорбция глюкозы, витаминов, белков, микроэлементов, значительное количество ионов Na⁺ и Cl^- [4, 11, 15].

Обратное всасывание в проксимальном сегменте невозможно без различных насосов, которые располагаются в основном базальной части клеток [7,10,15]. Мембранные разрастания эпителиоцитов I и II типа проксимальных участков, скорее всего, необходимы для более эффективного функциони­рования данного механизма. Как уже было упомянуто ранее в проксимальных участках канальцев морских рыб кроме реабсорбции Na⁺ и Cl^- происходит активная секреция двухвалентных ионов, а иногда и К⁺. Согласно гипотезе Ю. В. Наточина секреция К⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, а так же фосфатов и сульфа­тов происходит по механизму ионного обмена на реабсорбируемый Na⁺ данный процесс осуществля­ется с помощью Na⁺/K⁺, Na⁺/Ca²⁺, Na'/Mg²' и ClVPO³₄, ClVSO³₄ АТФаз [10]. Можно предположить, что образование сложных мембранных переплетений у основания клеток и большое количество мито­хондрий, находящееся в непосредственной близости к этим образованиям в проксимальных сегмен­тах ставриды и морского карася обусловлено формированием в них системы секреции двухвалентных ионов. Развитие гладкого эндоплазматического ретикулума на прямую связано с этим механизмом, так как этот органоид представляет собой молекулярную основу для работы насосов [3,7]. Перенос большого количества органических молекул, в том числе мочевины и большего, по сравнению с пре­сноводными рыбами, количества воды [1,7,13] обуславливает наличие большого числа везикул в ци­топлазме эпителиоцитов проксимального участка канальца морских рыб.

Кроме реабсорбции клетки проксимального сегмента костистых рыб выполняют так же и экс­креторную функцию. Эпителиоциты как пресноводных, так и морских рыб экскретируют креати­нин, некоторые органические кислоты и чужеродные вещества [13]. Выполнение этой функции подтверждается большим количеством лизосом в эпителиоцитах как I, так и II типа. Особенно они многочисленны в клетках ставриды и морского карася.

Как уже было упомянуто ранее, большое количество митохондрий в клетках проксимального участка канальца, скорее всего, обусловлено тем, что для осуществления противоградиентных сорб­ционных и секреторных процессов необходимо большое количество энергии. Следует отметить, что у ставриды и морского карася количество митохондрий больше, чем у пресноводных рыб. Это, скорее всего, связано с большей осмолярностью крови морских рыб по сравнению с пресноводны­ми, а так же, возможно, с меньшим уровнем синтеза АТФ у пресноводных рыб по сравнению с мор­скими (как это было показано для хлоридных клеток жабр) [3,6,7,10].

Долгое время считалось, что щеточная каемка, характерная для всего проксимального учаска канальца, сформирована по аналогии с млетопитающими и образована микроворсинками [1,2,10,12]. Но в нашей работе четко показано, что щеточная каемка, всех исследованных видов рыб, имеет в своем составе кроме микроворсинок - микрореснички, ультраструктура которых по­добна таковой описанной для трахеи высших позвоночных [14,15].

Второй участок канальца у судака и синца был сформирован эпителиоцитами, которые имели сходные черты строения с эпителиоцитами промежуточного участка канала у некоторых лососеоб­разных видов [2]. Ранее в литературе упоминалось наличие этого участка канала у некоторых пре­сноводных костистых рыб и круглоротых [1,2,10,12,13].

Опираясь на данные литературы, а так же собственные результаты можно предположить, что проме­жуточный участок канала присутствует у всех видов пресноводных костистых рыб, но так как эти клетки ог­раничивают небольшой отрезок нефрона, то обнаружить и описать их крайне сложно. В связи с тем, что в цитоплазме клеток промежуточного участка канала практически не были представлены структуры, участ­вующие в реабсорбции и обработке органических веществ, количество органоидов, участвующих в секре­торной деятельности клеток так же было незначительно, можно предположить, иную функцию данного ти­па клеток. Такая внутренняя структура клеток свидетельствует об аналогии этих клеток с клетками тонкого сегмента петли Генле нефронов теплокровных животных, основная функция которых проведение воды [2,14,15]. Специализация этих клеток у синца и судака не достигает уровня специализации клеток тонкого сегмента петли Генле в нефроне птиц и тем более в нефроне млекопитающих животных. В дальнейшем в филогенезе усовершенствование системы идет в направлении еще большего уплощения клеток, что дает возможность укорочения пути проходимого водой [2,14,15,].

Эпителиоциты дистального участка канала ставриды и морского карася отличались от пресновод­ных представителей большим количеством везикул, распределенных по всей цитоплазме. Скорее всего, это связано с особенностями функционирования дистального сегмента. Как известно, этот участок играет важнейшую роль в регуляции объема выделяемой мочи [12,13]. У пресноводных рыб реабсорбция в этом участке канальца характеризуется тем, что клетки переносят меньшее количество ионов, чем в прокси­мальном участке, но против большего градиента концентрации, так как вода здесь практически не сорби­руется [13]. Скорее всего, именно этот факт связан с наличием большего числа митохондрий эпителиоци­тов дистального сегмента по сравнению с проксимальным. Большее количество митохондрий в дисталь­ном участке канальца у ставриды и морского карася по сравнению с пресноводных особями мы так же связываем с большим осмотическим давлением крови морских рыб по сравнению с пресноводными [6,10]. У морских рыб факультативная реабсорбция воды в этом участке канальца выражена в большем количестве, чем у пресноводных. Кроме того, в дистальном сегменте K⁺ может не только реабсорбиро­ваться, но и секретироваться [13]. Скорее всего, эти процессы связаны с наличием большого числа вези­кул в цитоплазме дистального участка канальца ставриды и морского карася.

Таким образом, выявленные особенности ультраструктуры эпителиоцитов основных отделов нефрона между пресноводными и морскими видами, отражают различия в ионной регуляции у дан­ных видов рыб. Различия в размерных характеристиках каждого типа эпителиоцитов у разных ви­дов имеют, по-видимому, видовую специфику, тогда как другие признаки (количество и плотность секреторных гранул и лизосом, положение митохондрий, плотность цитоплазмы, различные вклю­чения и.т.д.) связаны, скорее всего, не с особенностями морфологии различных типов эпителиоци­тов, а со степенью функциональной активностью клеток.

Литература

Аминева В. А., Яржомбек А. А., 1984. Физиология рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность. 200 с.

Винниченко Л. Н., 1980. Сравнительная ультраструктура нефрона. Атлас. Л.: Наука. 136 с.

Виноградов Г.А., 2000. Процессы ионной регуляции у пресноводных рыб и беспозвоночных. М.: Нау­ка. 216 с.

Гинецинский А.Г., 1964. Физиологические механизмы водно-солевого равновесия. М-Л.: Наука. 426с.

Кауфман З. С., 1990.Эмбриология рыб. М: ВО Агропромиздат. 272 с.

Мартемьянов В. И., 1992. Содержание катионов в плазме, эритроцитах и мышечной ткани рыб Волж­ского плеса Рыбинского водохранилища // Журн. эволюц. биох. и физиол. Т. 28, № 5. С. 576-581.

Матей В. Е., 1996. Жабры пресноводных костистых рыб: Морфофункциональная организация, адапта­ция, эволюция. СПб.: Наука. 204 с.

Микряков В. Р., Балабанова Л. В., Заботкина Е. А., Лапирова Т. Б, Попов А. В., Силкина Н. И., 2001. Реакция иммунной системы рыб на загрязнение воды токсикантами и закисление среды. М.: Наука. 126 с.

Миронов А. А., Комиссарчик Я. Ю., Миронов В. А., 1994. Методы электронной микроскопии в биоло­гии и медицине. СПб.: Наука. 400 с.

Наточин Ю.В., 1976. Ионрегулирующая функция почки. Л.: Наука. 268с.

Покровский В. М., Коротько Г. Ф., 1998. Физиология человека. В 2-х томах. М.: Медицина. Т. 2. 368 с.

Пучков Н. В., 1941.Физиология рыб. М.: Пищепромиздат. 298 с.

Смит Л. С., 1986. Введение в физиологию рыб. М.: Агропромиздат. 168 с.

Улумбеков Э. Ю., Челышев Ю. А, 2002. Гистология. М.: ГЭОТАР-МЕД. 672 с.

Хэм Ф., Кормак Д., 1983. Гистология. В 5 томах. М.: Мир. Т. 2. 120 с.

Brown M.E., 1957. The physiology of fishes. New York: Academic press. V. 1. 447 p.

FEATURES OF EPITHELIAN CELL STRUCTURE OF TRUNK KIDNEY IN BONY FISH AND THEIR RELATIONSHIP WITH THEIR FUNCTIONS.

Е.А. Nazarova

Papanin Institute for Biology of Inland Waters RAS, Borok, Yaroslavl reg., Russia e-mail: katarinum@mail.ru

Fine structure of epithelian cell of 7 fish species of Cypriniformes and Perciformes were examined. Difference in nephron ultrastructure by quantity and sizes of some organelles were found between marine and freshwater bony fish. Two types of epithelian cells of proximal segment tubule were revealed in all examined fish species, differing in strain size and qualitative characteristics. An intermediate segment tubule was found in nephron of Abramis ballerus (L.) and Stizostedion lucioperca (L.).