Рациональное размещение лабораторного оборудования

Необходимым условием использования ПЦР является правильная организация работы в лаборатории. В связи с высокой чувствительностью реакции амплификации, основные усилия должны быть направлены на предотвращение загрязнения (контаминации) образцов.

Различают три основных потенциальных источника загрязнения.

1. Загрязнение вещественных доказательств или подготовленной к ПЦР пробы геномной ДНК, попавшей из внешней среды.
2. Загрязнение между образцами во время выделения ДНК или постановки ПЦР.
3. Загрязнение образца ДНК, амплифицированной в процессе предыдущих реакций.

Кроме общих, принятых в экспертных лабораториях правил, направленных на

предотвращение загрязнения объектов (протирка инструментария этиловым спиртом после работы с очередным объектом; использование стерильных пробирок, наконечников; смена наконечника после каждого объекта и т.д.), следует указать на некоторые специальные правила, которые должны выполняться при использовании ПЦР [6].

В лаборатории должно быть 3 зоны.

Зона для выделения ДНК предназначена только для работы с вещественными доказательствами (осмотр, фотографирование, подготовка материала к исследованию), а также для проведения всех этапов выделения ДНК.

Антиконтаминационные меры в этой зоне следующие.

1. С целью предотвращения загрязнения между материалом вещественных доказательств и образцами, представленными для сравнения, выполнять выделение ДНК из указанных объектов в разное время.
2. Для того чтобы свести к минимуму перенос ДНК между разными экспертными объектами, производить выделение ДНК из образцов, содержащих большие количества ДНК (например, цельная кровь), отдельно от образцов, содержащих малые количества ДНК (следы крови малых размеров, единичные волосы и т.д.).
3. Избегать расходования большого количества материала для единичной процедуры выделения ДНК.
   Для ПЦР достаточно небольших количеств ДНК. Концентрировать в рабочей зоне большие количества ДНК (микрограммы) не рекомендуется. Кроме того, целесообразно оставлять материал для повторного выделения ДНК, если это окажется необходимым. Вероятность случайного загрязнения в разных порциях материала очень мала.
4. Стерилизовать в автоклаве растворы, которые могут быть подвергнуты автоклавированию: лизирующий раствор, ЭДТА, NaCl, SDS, трис-HCl, а также деионизированную воду. В случае, если растворы были загрязнены ДНК, в условиях стерилизации она распадается на фрагменты очень низкого молекулярного веса, что делает ее неамплифицируемой.
5. Хранить реагенты разлитыми на небольшие порции. Отмечать порцию, которую использовали при работе с каждой серией образцов, с тем чтобы было легче обнаружить источник загрязнения в случае, если оно произошло.
6. Избегать разбрызгиваний. Некоторые типы пробирок имеют крышки, открывающиеся с трудом, что может вызывать разбрызгивание при открывании. Перед открыванием жидкость со стенок пробирки рекомендуется сбрасывать путем центрифугирования. Использовать устройство для открывания крышек.
7. Включать в исследование каждой серии проб ДНК так называемую "пустую" пробу для контроля наличия загрязнений реагентов ДНК.
8. Использовать при выделении ДНК ограниченное количество образцов (не более 15). Это уменьшит риск их загрязнения.
9. Использовать лабораторные халаты, предназначенные для работы с неамплифицированными образцами.

Зона постановки ПЦР предназначена только для внесения в амплификационные пробирки реагентов и ДНК.

Антиконтаминационные меры в этой зоне следующие.

1. Весь используемый для работы инструментарий должен быть предназначен только для работы в этой зоне. Дозаторы, штативы, пинцет, ножницы предварительно обработать спиртом. Для внесения реагентов и ДНК использовать разные дозаторы.
2. Работать в перчатках и чистых халатах. Менять перчатки, если на них попала ДНК.
3. Вносить ДНК в пробирку в последнюю очередь.
4. Не "выдувать" остатки ДНК из наконечника.
   "Выдувание" приводит к образованию аэрозоля, который может загрязнять другие пробы ДНК.
5. После добавления очередной пробы ДНК закрывать предыдущую пробирку крышкой.
6. Пробирку с отрицательным контролем (реагенты без ДНК) закрывать в последнюю очередь, после того как во все пробирки ДНК уже добавлена. Это обеспечит контроль за загрязнением реагентов во время постановки ПЦР.
7. Не прикасаться к внутренней поверхности пробирок.
8. Реагенты для ПЦР хранить в коробке, защищающей их от экзогенного загрязнения. Если реагенты хранятся в холодильнике, который находится в зоне для выделения ДНК, то для них должна быть отведена специальная полка.

Зона амплификации обязательно должна быть отделена от первых двух зон. Она предназначена для проведения амплификации и всех операций, связанных с амплифицированной ДНК: электрофореза продуктов ПЦР, гибридизации и окрашивания фильтров, утилизации амплификатов и хранения амплифицированной ДНК.

С амплифицированной ДНК следует обращаться осторожно, чтобы снизить вероятность ее попадания в другие зоны.

Антиконтаминационные меры в этой зоне следующие.

1. Перчатки, в которых работают в этой зоне, не должны использоваться для работы в других зонах.
2. Если на перчатки попала амплифицированная ДНК, сменить их или обработать спиртом.
3. Открывать пробирки с продуктами ПЦР осторожно, не разбрызгивая содержимое.
4. Использовать амплификатор только для амплификации и денатурации амплифицированной ДНК при типировании. Не использовать амплификатор для инкубации неамплифицированной ДНК.
5. Если электрофоретическая оценка неамплифицированной ДНК также проводится в этой зоне, целесообразно вносить в эту зону лишь аликвоты геномной ДНК, предназначенные для нанесения.
6. Гибридизационные фильтры и гели, содержащие амплифицированную ДНК, фотографировать отдельно от вещественных доказательств.
7. Хранить ДНК, амплифицированную в данной рабочей зоне, отдельно от реагентов и геномной ДНК.

Во всех трех зонах рабочие поверхности периодически обрабатывать дезинфицирующими средствами. Использовать кварцевание. (Не подвергать воздействию УФЛ минеральное масло: это может вызвать ингибирование ПЦР.)