ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК

Методики выделения ДНК из крови и спермы соответствуют принятым в настоящее время в зарубежной практике [6].

Выделение ДНК из крови фенольным методом

1. В стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл вносят 0,5 мл лизирующего раствора; добавляют 50 мкл жидкой крови или помещают вырезку из пятна крови размером приблизительно 1 см2 (размер вырезки из пятна, представленного в качестве вещественного доказательства, может быть большим).
2. Добавляют протеиназу К до конечной концентрации 300 мкг/мл (15 мкл при исходной концентрации протеиназы К 10 мг/мл), осторожно перемешивают.

Выдерживают при температуре 56 °С.

3. Предмет-носитель удаляют стерильным наконечником.
4. Отделяют ДНК от белковых фрагментов следующим образом:

а) к полученному продукту лизиса и ферментной обработки добавляют равный объем фенола; закрывают пробирку крышкой и перемешивают на вортексе;

б) центрифугируют в течение 3 мин при 10000 об/мин, до разделения двух фаз;

в) пипеткой со стерильным наконечником переносят верхнюю, водную, фазу в чистую микроцентрифужную пробирку.

5. Добавляют равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1). Повторяют действия, описанные в п. 4.
6. К водной фазе добавляют равный объем хлороформа. Повторяют действия, описанные в п. 4.
7. К водной фазе, перенесенной в чистую пробирку, добавляют NaCl до концентрации 0,2 М и два объема охлажденного 96 %-ного этанола, перемешивают, покачивая пробирки, и оставляют при температуре -20 °С на 1-2 ч (или на ночь). Центрифугируют в течение 10 мин при скорости 10000 - 15000 об/мин. Осадок промывают 80 %-ным этанолом и центрифугируют в том же режиме. После этого осадок высушивают и растворяют в 30 мкл деионизированной воды.

Для образцов, содержащих малые количества ДНК или требующих очистки, рекомендуется проводить дополнительную обработку с использованием устрой-ства “Центрикон-100”, в соответствии с приложенной изготовителем инструкцией.