ОЦЕНКА ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК
Количественную и качественную оценку выделенной ДНК проводят, осуществляя электрофорез в 0,8-2 %-ном агарозном геле. Для его приготовления рассчитанное количество агарозы смешивают с соответствующим объемом ІхТВЕ-буфера, смесь нагревают до полного растворения агарозы (удобно для этого использовать магнитную мешалку с подогревом или печь СВЧ).
Остудив раствор до 50 - 60 °С, выливают его в форму, помещают в нее гребенку для образования лунок. Толщина геля составляет приблизительно 3 мм. После застывания геля гребенку удаляют и переносят гель в электрофорезную камеру с ІхТВЕ-буфером.Смешивают 1 - 3 мкл исследуемой ДНК (выделенной фенольным методом) и аликвоту электрофорезного буфера с буфером для нанесения проб в соотношении приблизительно 1:6 и вносят в лунку геля. Используют также стандартную ДНК фага лямбда, нанося по 0,05; 0,1; 0,2 мкг (ее количество можно варьировать, исходя из ожидаемой концентрации исследуемой ДНК).
Электрофорез проводят при напряжении 50 - 100 В. По окончании электрофореза ДНК окрашивают, добавляя в электрофорезный буфер бромистый этидий. Можно также вносить бромистый этидий на более раннем этапе - в раствор агарозы.
Оценку результатов осуществляют, осматривая гель в УФЛ. ДНК без признаков деградации определяется как четкая дискретная полоса, расположенная на одном уровне с ДНК фага лямбда. Сравнивая по интенсивности свечения исследуемую ДНК с ДНК фага лямбда различной концентрации, определяют количество ДНК в аликвоте. После этого рассчитывают концентрацию и общее количество выделенной ДНК. Например, содержание ДНК в 3 мкл пробы соответствует 0,3 мкл стандарта. Следовательно, концентрация выделенной ДНК составляет 0,1 м^/мкл. Если общий объем пробы составляет 30 мкл, то количество ДНК в ней - 3 мкг.
При наличии деградации той или иной степени на дорожке появляется "шлейф" из фрагментов различной длины. Диапазон длин фрагментов выделенной ДНК можно оценивать путем сравнения их по уровню расположения с какой-либо соответствующей стандартной фрагментированной ДНК. Если ДНК без признаков деградации или фрагменты ее имеют длину более 2000 пар нуклеотидов (п.н.), она амплифицируется по всем обычно исследуемым локусам (если, разумеется, отсутствуют другие причины, приводящие к отрицательному результату). Как правило, амплификабельна ДНК и при наличии фрагментов длиной 1000-2000 п.н. При величине фрагментов менее 1000 п.н. исход реакции при исследовании разных локусов бывает неодинаков. При выраженной деградации ДНК предпочтительным является типирование локусов, аллельные варианты которых содержат короткие последовательности ДНК - STR-локусы, ген HLA DQ„ и др.