Выделение ДНК из крови с использованием Chelex

1. В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл вносят 1 мл стерильной дистиллированной водія. Добавляют 3 мкл жидкой крови или помещают вырезку площадью около 3 мм , и осторожно все перемешивают.
2. Выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.
   Время от времени перемешивают, осторожно встряхивая пробирку или используя вортекс. Можно поместить пробирку на качающуюся платформу. Если исследуется пятно крови, срок экстрагирования целесообразно увеличить.
3. Центрифугируют в течение 2-3 мин при 10000 - 15000 об/мин.
4. Удаляют супернатант, оставив в пробирке 20 - 30 мкл. При исследовании пятна в пробирке с осадком оставляют также предмет-носитель.
5. Добавляют 5 %-ную взвесь Chelex до конечного объема 200 мкл. Когда отбирают Chelex, взвесь должна быть однородной. Для этого во время отбора Chelex перемешивают с использованием магнитной мешалки, наконечником с достаточно большим диаметром отверстия (на 1 мл).
6. Выдерживают при температуре 56 °С в течение 15-30 мин.
7. Перемешивают на вортексе в течение 5 - 10 с.
8. Выдерживают в кипящей воде или в термостате с ячейками при температуре 100 °С в течение 8 мин.
9. Перемешивают на вортексе в течение 5 - 10 с.
10. Центрифугируют в течение 2-3 мин при 10000 - 15000 об/мин.
11. Для постановки ПЦР в амплификационную смесь вносят 10 - 20 мкл супернатанта.
12. Остатки супернатанта хранят при температуре 2 - 8 °С или -20 °С.

При повторном использовании производят действия, указанные в пп. 9-11.

Выделение ДНК из спермы с использованием Chelex

1. Делают вырезку из пятна, разъединяют нити предмета-носителя.
2. В микроцентрифужную пробирку вносят 1 мл стерильной дистиллированной воды и помещают в нее вырезку.
3. Выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, поместив пробирку на качающуюся платформу.
   В зависимости от характера пятна, срок инкубации может быть увеличен.
4. Удаляют предмет-носитель.
5. Центрифугируют в течение 1 мин при 10000 - 15000 об/мин.
6. Пастеровской пипеткой или наконечником дозатора на 1 мл осторожно удаляют супернатант, оставив около 50 мкл. Суспендируют осадок в оставшемся объеме. Этот осадок содержит и сперматозоиды, и эпителиальные клетки.
7. Отбирают 3 мкл взвеси, наносят ее на предметное стекло. Фиксируют и окрашивают так, как это описано выше. После этого микроскопируют. При обнаружении сперматозоидов проводят дальнейшее исследование. Если в препарате имеются также эпителиальные клетки, проводят процедуру дифференцильного лизиса, начиная с п. 8. Если эпителиальных клеток не обнаружено, то приступают сразу к выполнению п. 16.
8. К 50 мкл клеточной взвеси добавляют стерильную дистиллированную воду до конечного объема 200 мкл. Вносят 2 мкл протеиназы К (при концентрации ее 10 мг/мл). Осторожно перемешивают.
9. Выдерживают при температуре 37 °С в течение 1-2 ч для лизиса эпителиальных клеток. (Срок инкубации не должен превышать 2 ч, чтобы не произошел лизис сперматозоидов.)
10. Центрифугируют в течение 5 мин при 10000 - 15000 об/мин.
11. Отбирают 150 мкл супернатанта и добавляют к нему 50 мкл 20 %-ной взвеси Chelex. Фракцию эпителиальных клеток сохраняют для последующего анализа (с п. 18).
12. Отмывают спермальный осадок следующим образом. Суспендируют осадок в 0,5 мл лизирующего буфера Перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 мин при 10000-15000 об/мин. Удаляют супернатант, оставив 50 мкл осадка
13. Повторяют (1-2 раза) действия, указанные в п. 12.
14. Однократно отмывают осадок дистиллированной водой следующим образом. Суспендируют осадок в 1 мл воды, перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 мин при 10000 - 15000 об/мин. Удаляют супернатант, оставив около 50 мкл.
15. Суспендируют осадок и проводят его цитологическое исследование, как описано выше.
16. К взвеси сперматозоидов добавляют 150 мкл 5 %-ной взвеси Chelex (до конечного объема приблизительно 200 мкл). Вносят 2 мкл 10 мг/мл протеиназы К и 7 мкл 1 М раствора DTT. Осторожно перемешивают.
17. Выдерживают при температуре 37 °С в течение 30 мин - 1 ч.
18. Перемешивают на вортексе (в течение 5 - 10 с) фракции эпителиальных (см. п.

11. и спермальных клеток.

19. Центрифугируют в течение 10 - 20 с при 10000 - 15000 об/мин.
20. Выдерживают в кипящей воде или в термостате с ячейками в течение 8 мин.
21. Перемешивают на вортексе в течение 5 - 10 с.
22. Центрифугируют в течение 2-3 мин при 10000 - 15 000 об/мин.
23. Для постановки ПЦР в амплификационную смесь рекомендуется вносить 20 мкл супернатанта.
24. Остатки супернатанта хранят при температуре 2-8 °С или -20 °С.