1.2.3. ИММОРТАЛИЗИРУЮЩИЕ И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ДНК-СОДЕРЖЛЩИХ ОПУХОЛЕРОДНЫХ ВИРУСОВ ГРУППЫ полиомы
Прежде чем перейти к характеристике онкогенов указанной іруппьі вирусов, целесообразно для понимания механизмов онкогенеза остановиться на общих положениях вирус ною канцерогенеза
В настоящее время известно более 160 опухолеродных вирусов, которые подразделяются на две большие группы: ДНК- и РНК-содержащие.
Основным общим их свойством является способность трансформировать нормальные клсіки в опухолевые in vitro и иногда вызывать образование злокачественных новообразований у животных in vivo. РНК-содсржащие онковирусы (подсемейства онкорнавирусов семейства ретровирусов — онкогенные ретровирусы) представляют собой более многочисленную уникальную іруїіпу и являются возбудителями злокачественных новообразований у естественных хозяев, тогда как среди ДНК-содержащих опухолеродных вирусов (семейства папова-, адено- и герпесвирусов, оспенных вирусов и гепадновирусов) только две группы (вирусы папиллом и семейства герпесвирусов) обладают этим свойством, несмотря на исключительно широкое распространение в природных условиях (практически все взрослые животные сероположительны) [Агеенко А. И., 1969, 1974, 1975, 1978, 1986; Зильбер Л. А. и др., 1975; Струк В. И., 1982; Быковский А. Ф. и др., 1983; Gross L., 1970; Temin Н. М., 1988; Dalgleish A. G. 1991].Основной (а иногда, может быть, единственный) путь передачи ДНК- содержащих опухолеродных вирусов — горизонтальная инфекция, причем она может иметь место в самые первые дни после рождения. Общим биологическим свойством ДНК-содержащих опухолеродных вирусов является их способность вызывать как острый цитоцидный (клетки природного хозяина — пермиссивные клетки, позволяющие вирусу осуществить полный репродуктивный цикл), так и абортивный (нспермиссивные или полупермис- сивные клетки) тип инфекции, иногда приводящий к неопластической тран
сформации пораженных клеток. Следовательно, чтобы трансформировать клетку природного хозяина, необходим либо дефектный, либо инактивированный вирус, но, естественно, содержащий трансформирующие области (онкогены).
Иными словами, необходимо прерывание продуктивной инфекции, обычно происходящее на поздних стадиях вирусной репродукции (все поздние стадии, в том числе и репликация ДНК) в нспсрмиссивных клетках, а в полупермиссивных клетках — на стадии сборки вирусных частиц.Центральный постулат вирусогенстической теории происхождения опухолей, сформулированной Л. А. Зильбером в начале 60-х годов о необходимости интеграции вирусного генома с клеточным для стабильной опухолевой трансформации, на сегодняшний день подвергся частичной ревизии. Оказалось, что в некоторых случаях само присутствие частично или полностью активного вирусного генома в пермиссивных и непсрмиссивньгх клетках в форме эписом, т. е. не связанного с хромосомной ДНК (экстрахромосомно) или связанного с ядерной ДНК лабильными водородными связями, может обеспечивать проявление определенных свойств неонластически трансформированных клеток или полностью стабильно поддерживать опухолевый фенотип. Такое вирус-клеточное взаимодействие преимущественно свойственно папиллома- и герпесвирусам. Интеграция, обусловливающая стабильную трансформацию, характерна, как правило, для полиома-, адено- и ретровирусов. Вместе с тем описана также способность некоторых паповавирусов персистировать в свободном неинтеїрированном состоянии, когда функционирование их генов находится под неизвестным клеточным контролем, препятствующим синтезу инфекционного вируса. Поданным рестрикционною анализа, неинтегрированные вирусные последовательности представляют собой кольцевые, ковалентно замкнутые ДНК длиной в целый геном, например ДНК SV40. Не обнаружено разницы в структурах эписомной вирусной ДНК в клетках, трансформированных SV40 дикою типа и мутантом А1499 JRama- gopal S., 1983J.
Внедрение новой, вирусной ДНК (или ДНК-провируса ретровирусов), содержащей различные регуляторные последовательности, и ее взаимодействие с геном клетки не всегда остаются «бесследными» для клетки Важно замегить, что способность опухолеродных вирусов вызывать фенотипические и генетические изменения прежде всею связана со свойством их геномов интегрировать с генетическим аппаратом клетки.
Установлено, что интеграция происходит не только при трансформации, но и при продуктивной инфекции опухолеродными вирусами (когда воспроизводится новое вирусное потомство) и, вероятно, является их характерным признаком, а в случае ретровирусов — одним из этапов их вегетативного репродуктивною цикла. Причем для онкогенеза наибольшее значение имеют прежде всего уник к ь- ные стадии — синтез ДНК на матрице РНК и интеграция вновь синтезированного ДНК-провируса в клеточный юном. В процессе жизненного цикла ретровирусов, как установлено, в зараженной ими клетке образуется три типа молекул провирусной ДНК: линейная и две кольцевые, различающиеся между собой количеством длинных концевых повторов (ДКП). Причем один тип кольцевых молекул содержит два спаренных ДКП — так называемай папин- дромная последовательность (Lobel L. I. et al., 1989J. Пока не ясно, какой из этих трех типов молекул ДНК-провируса отвечает за ею дальнейшую интеграцию в клеточный геном.Таким образом, в инфицированных ретровирусами клетках в результате
обратной транскрипции образуются провирусы, представляющие собой новые генетические элементы. Эти генетические структуры насыщены сигналами, которые регулируют транскрипцию, трансляцию и сплайсинг. С одной стороны, они могут влиять на экспрессию клеточных генов, а с другой, могут осуществлять синтез новых для клетки вирусных РНК и белков. Большая часть этих сигналов сконцентрирована в LTR (long terminal repeat — large terminal redundacy—длинные прямые концевые повторы) и, следовательно, дублирована. LTR имеют структуру U3-R- U5 и располагаются на концах линейной ДНК, синтезированной ревертазой на матрице вирусной РНК. Затем образуется циркулярная ДНК с одним и двумя LTR. LTR содержат цисдействующую узнавающую последовательность для фсрмеїгга, осуществляющего интеграцию, поскольку интегрируют только циркулярные молекулы. Этот участок обозначен att (attchment). Показано, что кольцевые молекулы с одним LTR являются побочным продуктом и не участвуют в интеграции [Panganiban А.
Т., 1985; Aronoff R., Linial М., 1991].Интеграция ретровирусной ДНК в геном клетки включает стадию специфического расщепления вирусной кольцевой ДНК эндонуклеазой, кодируемой геном pol (Endo-pol). В реакции in vitro Endo-pol расщепляет обе цепи репликативной формы ДНК вирусов сарком и лейкозов птиц в области сочленения доменов U3 и U5 LTR. Для специфического расщепления вирусной кольцевой ДНК и интеграции этой ДНК в клеточный геном необходимо не более 22 п. н. домена 5 и не более 8 п. н. домена 3. С помощью серии делеционных мутантов продемонстрировано, что утрата необходимых для расщегиіения последовательностей препятствует размножению вируса |Со- Ьгіпі К. D. et al., 1987]. Показано, что повреждения 3'-концевой области гена рої вируса лейкоза мышей делают вирус дефектным по интеграции. Оказалось, что псевдотипы, образованные из белков таких дефектных по интеграции ретровирусов и ДНК другого мутанта, дефектного по репликации, все же способны с низкой частотой вызывать трансформацию клеток (Hagino-Yam- agishi К. et al., 1987]. Предполагают, что при этом происходит неспецифическая интеїрация в геном клетки димерных или тримерных форм провирусной ДНК, механизм возникновения которых пока нс ясен.
Итак, получены генетические доказательства того, что ДНК-эндонуклеаз- ный домен белка рої ретровирусов необходим для интеграции их провируса в клеточный геном {Quinn Т. Р., Grandgenett D. Р., 1988].
G. Qualandi и соавт. (1990) представили материалы рестрикционного анализа, подтверждающие гипотезу об интеграции ДНК вируса Эпштейна-Барр (EBV) в геном клеток человека с вовлечением сегмента, от которого зависит репликация этой ДНК. Вероятно, разрушение этого сегмента опР (единственного сегмента, ответственного за воспроизведение эписом EBV) является необходимым условием для сохранения генома EBV, интегрированного в хромосомы человека.
Интеграционный принцип взаимодействия вирусного генома с геномом клетки имеет, по-видимому, большое общсбиологическос значение. Вероятно, он наряду с мутациями и рекомбинациями является фактором эволюции, обеспечивающим обмен генетической информацией в биосфере как внутри видов, так и между особями, которые принадлежат к разным таксономическим группам среди эу- и прокариот.
Иногда же могут возникать «интегративные» патологические процессы, например аутоиммунные болезни, опухолевая трансформация, аномальные типы «обычных» и «медленных» вирусных
инфекций и др. Поэтому изучение закономерностей и механизмов интеграции принципиально важно не только для понимания опухолевой трансформации.
Вместе с тем механизм физической интеграции вирусной и клеточной ДНК практически не исследован, особенно плохо изучены последовательные промежуточные этапы этого процесса. Мало известно о вирусных и клеточных факторах, ферментных системах, осуществляющих рекомбинации вирусного и клеточного геномов. Остается открытым вопрос о специфичности мест интеграции в отношении клеточного генома, хотя продолжают накапливаться факты об интеграции некоторых опухолеродных вирусов только в определенное место определенных хромосом. Например, трансферирован- ные в 6 клонов фибробластов человека ДНК рекомбинантного гибридного вируса аденовирус типа 5 — SV40 преимущественно интеїрировали в два участка хромосомы 1, а именно, в короткое плечо субтеломерной области (1р35-р ter) и длинное плечо субтеломерной области (lp42-pter), где при аденовирусной инфекции образуются бреши в районе маркерных генов А12М2 и А12МЗ. Следует обратить внимание на то, что сайт модификации 1 р (А 12М2) в ДН К аденовируса типа 12 служит также сайтом преимущественной интеграции гибридного вируса в клетках человека. ДНК вируса папилломы человека интегрирует в три общих и один вариабельный сайт ДНК клеток Hela [Alhadeff В. et al., 1987]. Поданным гибридизации in situ, интегрированные последовательности ДНК вируса папилломы человека типа 16 располагаются только в хромосомной области 12ql4q-15 у линии клеток из внутриэпителиального новообразования вульвы |Sastre-Garau X. et al., 1990]. Определены три общих сайта интеграции вируса лейкоза мышей линии Френд при мие- лобластном лейкозе: Fim-1, Fim-2 c-fms и Fim-З, которые картируются на хромосомах 13; 18 и 3 соответственно (Sola В. et al., 1988].
Показано также, что иммортализация клеток происходит только в том случае, когда провирус вируса SFFV интегрирует в специфический сайт в клеточном геноме [Shiro G. et al., 1988]. Однако пока не ясны механизмы преимущественной интеграции с определенными клеточными локусами. Установлено, что активация репарационных систем не влияет на множественность интеграции и существует специфичность интеграции по отношению к вирусному геному.Следует особо подчеркнуть, что во всех случаях при интеграции опухолеродных вирусов рамки считывания трансформирующих областей всегда сохраняются, так же как и длинный контрольный район вируса.
Существенно, что в отличие от ДНК-содержащих опухолеродных вирусов клетки, зараженные ретровирусом, как правило, сохраняют жизнеспособность, продолжают размножаться, при этом изменяются генетически и фенотипически, одним из таких изменений является опухолевая трансформация. В зависимости от трансформирующего действия на клетки in vitro и способности вызывать различные типы новообразований in vivo ретровирусы можно разделить на 4 группы.
I. Высокоонкогенныевирусы, обладающие сильным (в основном вирусы сарком: RSV, FSV, PRCII, Mo-MSV, Ha-MSV и др. и за редким исключением вирусы острых лейкозов, например, МС29, СМИ, ОКЮ, МН2) трансформирующим действием на культуру фибробластов и вызывающие почти в 100% случаев у чувствительных животных главным образом саркомы и различные острые лейкозы с коротким латентным периодом (около 2 нед). В природных условиях эти вирусы обычно циркулируют в виде смешанных
популяций. Их основу составляют саркомно-лейкозные комплексы вирусов птиц и мышей (Skalka А. М. et al., 1989]. За исключением вируса саркомы Рауса (RSV) и близкородственных ему вирусов, все известные представители этой группы дефектны по репликации и близки по структуре. Бластомоген- ные потенции их обусловливаются наличием различных трансформирующих областей (генов опс-онкогенов), захваченных ими из генома клетки в процессе рекомбинации. Следовательно, они имеют клеточное происхождение. Ятя саморепродукции ретровирусов указанные гены не нужны, их последовательности не родственны последовательностям структурных вирусных генов (gag, рої и env), но зато близкородственны нуклеотидным последовательностям нормальных клеток. Онкогены ДНК-содержащих опухолсродных вирусов, наоборот, в процессе длительной эволюции стали необходимы для репликации вируса, однако их последовательности негомологичны клеточным последовательностям, т. е. вероятно, они превратились в вирусные и перестали быть клеточными.
Можно заключить, что вирусные онкогены имеют клеточное происхождение и возникли в результате редких трансдукций вирусами определенных клеточных последовательностей, которые в составе вирусного генома могут экспрессироваться в форме отдельных независимых или слитных белков. L. Н. Wang (1987) утверждает, например, что процесс трансдукции протоонкогена c-src ретровирусами птиц осуществляется в две стадии. На первой провирусная ДНК рекомбинирует с 5-областью протоонкогена. На второй стадии продукт транскрипции такой химерной последовательности рекомбинирует с РНК трансдуцирующего вируса. Причем второй акт рекомбинации происходит с существенно более высокой частотой, очевидно, из-за наличия увеличенных гомологий.
Идеальной системой для изучения механизма трансдукции протоонкогена считают эритробластоз, индуцированный вирусом лейкоза птиц при итерационной активации клеточного гена c-егЬВ fRaines М. A. et al., 1988]. В 25% проанализированных случаев этою лейкоза высвобождались зрелые ретровирусы, которые с необычно высокой частотой захватывали активированный онкоген егЬВ. Кроме тою, эти лейкозные образцы представляют собой богатый источник выделения новых вирусов, трансдуцирующих протоонкоген с- егЬВ. Некоторые провирусы сохраняли в своих геномах участки, соответствующие пол и-А в мРНК. Последовательности из 6 остатков аденозина в гене env вируса лейкоза птиц, вероятно, определяют З'-рекомбинацию, необходимую для образования этих вирусов. В последющей серии экспериментов были сделаны молекулярные характеристики трех егЬВ-трансдуцирующих вирусов, возникших при эритролейкозе, индуцированном вирусом лейкоза птиц. Оказалось, что протяженная внутренняя деления вблизи киназною домена активирует фибросаркомный и гемангиомогенный потенциал транслированного протоонкогена егЬВ.
Итак, ретровирусный онкоген v-erbB является мутантом гена c-егЬВ, который кодирует на поверхности клеток рецептор эпидермальною фактора роста (РЭФР). Мутации проявляются в трех формах: 1) большая деления, которая приводит к удалению целого лигандсвязывающего домена РЭФР; 2) меньшие делеции затрагивают карбоксил-терминальный домен РЭФР; 3) точечные мутации вызывают консервативные замены аминокислот. Показано, что при наїичии большой делеции не требуются другие мутации, чтобы фибробласты ірьізунов под действием гена с-еФВ приобретали онкогенный фенотип
(Wells A., Bishop J. M., 1988]. Особенно это касается делений, влияющих на карбоксильный конец продукта гена. Удаление лигандсвязывающею домена из РЭФР достаточно для получения трансформирующего белка. Деления карбоксильного конца РЭФР, по-видимому, играет вторичную роль в трансформации, воздействуя на круг хозяев и силу трансформации. Не получено данных о влиянии точечных мутаций на превращение гена с-егЪВ в онкоген. По-видимому, увеличение активности РЭФР способствует онкогенезу.
Молекулярно-биологическими методами установлено, что нормальные клетки позвоночных действительно содержат семейство таких эволюционно консервативных последовательностей (протоонкогенов). Очевидно, они непосредственно участвуют в дифференцировке клеток или других жизненно важных процессах и моїут вовлекаться в онкогенез, обусловливая, по-видимому, определенные этапы опухолевой трансформации клеток, однако после соответствующих мутаций.
Показано, что вирусные онкогены и клеточные протоонкогены, имеющие общие специфические последовательности, не изогенны IDucsberg Р. Н., 1983]. Они отличаются друг от друга по рассеянным точечным мутациям, наличию делений и уникальных кодирующих участков, которые отсутствуют у их клеточных гомологов, например протоонкогенов c-src, c-myc, c-ras, c-fps и др. [Lee W. Н. et al., 1983; Wang J., Yin J., 1983; Watson R. et al., 1983; Iba H. et al., 1984; Ricketts M. H. et al., 1988]. Естественно, что продукты вирусных и клеточных онкогенов также отличаются друг от друга и, следовательно, функционально моїут быть рахзичны: вирусные онкобелки трансформируют клетки, а продукты протоонкогенов могут выполнять разные нормальные функции как в эмбриогенезе, так и в физиологических процессах в организме [Muller R. et al., 1983; Watson R. et al., 1983]. Отмечено, что некоторые клеточные онкогены экспрессируются на определенных стадиях онтогенеза и при регенерации органов и тканей. Так, при регенерации печени в 2’/2-4 раза увеличивается количество транскриптов c-Ha-ras, c-K-ras и с-тус-специфи- ческих РНК [Goyette М. et al., 1983; 1984; Makino R. et al., 1984]. Причем высокий уровень экспрессии онкогенов в онтогенезе (например, гена c-src), по данным A. Bemekow и М. Gebler (1984), не всегда связан с пролиферацией, а, возможно, играет определенную роль на ранних стадиях дифференцировки мезенхимальных клеток или же осуществляет контроль метаболизма. В частности, J. G. Spivack и соавт. (1984) показали, что он контролирует прогестерониндуцирующее созревание ооцитов. Иными словами, протоонкогены, содержащие онкородственныс последовательности с вирусными трансформирующими генами, экспрессируются в нормальных клетках, как правило, в соответствии с нормальными функциями.
Итак, сравнительные исследования структуры вирусных онкогенов (особенно ретровирусов и протоонкогенов) выявили, что все вирусные трансформирующие области на самом деле в большей степени являются новыми генами, чем трансдуцированными клеточными. Протоонкогены часто экспрессируются в нормальных клетках. Не выделен ни один из протоонкогенов, который в активированном состоянии трансформирует диплоидные клетки, не обнаружено также диплоидно-клеточных опухолей с активированными протогенами. Более тою, оказалось, что вероятность спонтанной трансформации in vivo по крайней мере в 10’ раз ниже, чем это предсказано на основании гипотезы активации протоонкогенов [Duesberg Р. Н., 1987]. Следовательно, есть основания предполагать, что скорее всею только нарушения
целостности генов или рекомбинации, изменяющие конфигурацию генов клетки, могут приводит к образованию вирусных онкогенов и, возможно, клеточных онкогенов. Генетическая нестабильность и в первую очередь клональные аберрации хромосом, обусловливающие ее и постоянно присутствующие в опухолевых клетках, являются убедительным подтверждением необходимости генетических перестроек, которые приводят к возникновению неопластически трансформированных клеток. Таким образом, злокачественные новообразования, вероятно, могут возникать вследствие хромосомных аберраций, как это предполагали еще в 1911 г. К. Bauer и в 1914 г. Т. Boveri.
Что касается онкогенов ретровирусов (особенно острых лейкозов и сарком), то эта группа сыграла решающую роль в формировании концепции, согласно которой нормальные клетки содержат множество генов, потенциально способных становиться онкогенными детерминантами после трансдук- ции в геномы ретровирусов. Среди идентифицированных у вирусов острых лейкозов различных онкогенов, имеющих клеточное происхождение, наиболее подробно изучен онкоген myc, который участвует как в вирусиндуциро- ванном, так и невирусном онкогенезе. На моделях рсзровирусных лейкозов птиц впервые детально изучены основные свойства и уникальные варианты структуры и экспрессии онкогенов, в частности выявлена структура гибридных онкогенов, представленных клеточными и вирусными кодирующими последовательностями. Впервые описана сборка двух различных клеточных протоонкогенов в одном ретровирусном геноме пока только у трех вирусов: c-myb и c-ets у вируса лейкоза птиц ES4 и Е26, c-myc и c-mil у вируса МН2 и егЬА и егЬВ у вируса AEV (Graf Т. et al., 1986, 1988; Saule S. et al., 1987; Rupniwska Z., 1989]. Показана кооперация двух онкогенов в трансформации клеток, в частности, вирусом МН2, который быстро трансформирует in vitro гемопоэтические клетки кур. Анализ делеционных мутантов ретровирусов МН2 позволил установить, что эти два онкогена вместе создают систему аутокринного роста, в которой v-myc стимулирует клеточную пролиферацию, a v-mil индуцирует ФР миеломоноцитов кур (cMGF). В результате ретровирус МН2 эффективно индуцирует моноцитные лейкозы и опухоли почек, а делеционные мутанты МН2, лишенные как функциональной) гена v- mil, так и v-myc, не вызывают эти бластом атозные процессы.
Получены мутанты ретровируса МН2, содержащие по одному из этих онкогенов. На клетки нейроретины мутанты только с v-mil (продукт Р110*“*' ~*) оказывают митогенное действие, которое нехарактерно для мутантов только с myc (продукт Р61/63гаус). Существенно, что последние мутанты обладаю! способностью трансформировать фибробласты, чего не могут мутанты только с mil (Saule S. et al., 1987].
На системе клеток костного мозга показано, что онкоген егЬА ретровируса AEV, продукт которого гомологичен рецептору тиреоидного и стероидного гормонов, ответствен за блок в дифференцировке этих клеток, а егЬВ (его продукт гомологичен редуцированному рецептору ФР эпидермиса) — за неконтролируемую пролиферацию. Установлено, что егЬА-специфический белок содержится как в ядерной, так и цитоплазматической фракциях, причем обе формы способны связываться с ДНК и, очевидно, могут выполнять функции транскрипционных активаторов (Boucher Р. et al., 1988; Geary В. В., Privalsky М. L. 1990]. Способность этого белка связываться со специфическими сайтами на хроматине, что модифицирует экспрессию соседних генов, очевидно, является узловым моментом в механизме неопластической тран-
сформации. Продукт двух генов myb и ets ретровируса Е26 P135wmyb_eu вызывает смешанный эритроидно-миелоидный лейкоз у цыплят и трансформирует in vitro миелоидные и эритроидные клетки [Saule S. et al., 1987J. Предполагают, что myb-детерминанты осуществляют связь с ДНК и участвуют в трансформации миелобластов, а ets-детерминанты участвуют в трансформации эритроидных клеток и фибробластов. Обнаружено, что трансактивация необходима для трансформации клеток геном v-myb [Lane Т. et al., 1990].
Большой успех был достигнут в изучении функции клеточных аллелей онкогенов вследствие открытия высокой гомологии последовательностей между онкогенами вирусов лейкоза птиц и генами человека, кодирующими рецепторы ФР.
II. Вирусы острых лейкозов не содержат в составе своего генома клеточных онкогенов и таким образом отличаются от высокоонкогенных вирусов лишь механизмом трансформирующего действия, поскольку они могут in vitro трансформироватъ клетки разных типов, а у чувствительных животных они вызывают различные острые лейкозы со средним латентным периодом от 2 нед до нескольких месяцев. Вирусы этой группы могут быть как дефектными по репликации, так и недефектными; характеризуются средними и сильными бластомогенными потенциями. К последним, например, можно отнести дефектный по репликации и индуцирующий фокусы в селезенке вирус SFFV, возникший в результате делеции в основном гене env (область р15), который кодирует gp50—55. Этот гликопротсид, вероятно, является производным gp70, поскольку преципитирустся антисывороткой против gp70 MuLV [Frisby D. P. et al., 1-980; Mol J. N. et al., 1982; Clark S. P., Mak T. W., 1983; Adachi A. et al., 1984; Gonda M A. et al., 1984]. Вирус SFFV индуцирует фокусы пролиферирующих эритроидных клеток-предшественников в селезенке взрослых мышей и быстро вызывает эритробластоз у новорожденных и взрослых особей. Показано, что онкогенный потенциал SFFV обусловлен измененным продуктом гена env — белком gp50— 55, характеризующегося нарушенным процессингом и неспособностью к упаковке в вири- оны. Кроме того, различия в белковых продуктах генов env SFFV и других ретровирусов объясняют измененным характером гликозилирования gp50— 55 [Wolff L. et al., 1983]. Методами генетической инженерии установлено также, что измененный мембранный домен этого белка или утрата цитоплазматического домена в gp50— 55 (либо оба эти фактора) необходимы для индукции эритролейкоза под действием SFFV, однако они не связаны с нарушением способности gp50— 55 транс портироваться на клеточную поверхность [Srinivas R. V. et al., 1987; Watanabe N. ct al., 1990]. Индукция эритролейкоза, как выяснилось, зависит и от присутствия участка из b'3Fr-MuLV (Sitbon М. et al., 1990].
L. Wolff и S. Kuscetti (1988) после котрансфекции мышиных фибробластов рекомбинантной плазмидой с геном env и ДНК вируса-помощника удалось получить сток вируса SFFV, из всех вирусных белков экспрессирующего исключительно gp52. Такой вирус меньше чем через месяц после заражения вызывал эритролейкозы у 80— 100% животных и обладал способностью трансформировать эритробласты в культуре. Таким образом, ген env SFFV, действительно, является онкогеном вирусной природы.
В то же время ген env вирусов группы MCF (mine cells focus forming — образующие очаги трансформации в культурах клеток легкого норки) кодирует gp70, который трансформирует предшественников лимфо-
идных клеток. Оба трансформирующих белка содержат типоспецифические антигенные детерминанты, характерные как для основного гликопротеида оболочки экотропных вирусов MuLV-E, так и для аналогичного белка ксе- нотропного MuLV-X [Frisby D. Р. et al., 1980; Vogt P. K., 1982]. Следовательно, оба эти гликопротеида кодируются гомологичными генами и, несмотря на различия в молекулярной массе (gp50— 55 SFFV и gp70 MCF-MuLV), имеют сходную структуру. Белок gp50— 55 локализуется в основном в эндоплазматическом ретикулуме, ядерной фракции и частично на клеточной поверхности (gp70 также находится на поверхности клеток) и входит в состав вирио- нов. Продемонстрировано превращение вируса эритролейкоза Френд (С. Friend), вызывающего фокусы в клетках легкого норок, в вирус, индуцирующий фокусы в селезенке путем модификации 3' -половины гена env [Watanabe N. et al., 1991 ]. Возможно, лейкозогенное действие этих вирусов обусловлено изменением клеточной поверхности и в связи с этим модификацией пролиферативных потенций трансформированных клеток.
Показано, что gp50—55 необходим для инициации пролиферативной фазы эритробластов при эритролейкозе Френд и изменения в мембранах, вызываемые этим белком, могут быть скорее первичными причинами трансформации, а не только вторичным следствием развития бластоматозного процесса [Ruta М. et al., 1983]. В последующем оказалось, что данный вирусный белок путем непосредственною связывания с рецептором эритропоэтина (Еро-Р) в эндоплазматическом ретикулуме может стимулировать ею метаболизм и в отсутствии нормальных условий для функционирования этою рецептора способен вызывать пролонгированную пролиферацию инфицированных эритроидных клеток [Li J. Р. et al., 1990; Yoshimura A. et al., 1990]. Считают, что указанный процесс является первым этапом в индукции лейко- могенеза вирусом Френд. В то же время R. Paul и соавт. (1991) обнаружили в эритролейкозных клетках, зараженных этим вирусом, общий сайт интеграции провируса, обозначенный Spfi-1. С помощью генетических методов он обнаружен на хромосоме 2 мышей. Данные сиквснса свидетельствуют, что Spfi-1 кодирует белок, идентичный Pul, транскрипционному фактору, который родствен онкогенам семейства ets. Эти факты позволяют предполагать, что Pul блокирует дифференцировку эритробластов и вызывает иммортализацию клеток. Установлено также, что предрасположенность к эритролейко- зу контролируется клеточными генами U, S1 и Fv-2, а развитие процесса коррелирует с инактивацией гена-супрессора р53 и активацией генов семейства ets (Spl-l, Pul и Fll-1) [Ben-David Y., Bernstein A., 1991].
В группу II отнесены также лимфотропные вирусы человека: HTLV-I (вызывает кожный Т-клеточный лейкоз/лимфому взрослых) и HTLV-II, ассоциированный с Т-клеточными лейкозами, хотя окончательно спектр заболеваний не установлен. Кроме генов gag, рої и env, типичных для всею семейства ретровирусов, эти вирусы содержат юн x-lor(px) (локализован между геном env и З’-LTR). Вирус иммунодефицита человека HTLV-III (HIV), также относящийся к лимфотропным вирусам, имеет 6 дополнительных генов: 1) tat кодирует белок, контролирующий экспрессию вирусных мРНК; этот белок способствует увеличению концентрации РНК-полимеразы в районе промото ра, усиливая таким образом инициацию транскрипции, и, кроме того, способствует элонгации транскриптов; белок необходим также для экспрессии ієна env и переноса мРНК env в ядре; 2) rev контролирует функции различных мРНК, осуществляющих транспорт структурных протеинов вируса в
цитоплазму; 3) регуляторный ген ncf уменьшает экспрессию всех мРНК, иірая большую роль в латентной фазе развития вируса; 4) вирусный белок R гена vpr необходим для репликации и проявления цитопатогсн пости в лимфоидных клетках; 5) vif-регуляторный ген с малоизвестной функцией; 6) vpu (HIV-1) и vpx (HIV-2) и все вирусы иммунодефицита обезьян (SIV) увеличивают трансмиссионный потенциал вирусов и стимулируют продукцию антител у больных, могут быть использованы в диагностике. К настоящему времени четко определены два типа вирусов иммунодефицита человека, различающиеся по поверхностным гликоиротеидам: gpl 10—120 и gp41 (HIV-1) и gpl 25— 130 и gp36 (HIV-2).
На поверхности HIV имеется значительное число дискретных участков, представляющих собой мишени для иммунной атаки нейтрализующими антителами, антителами, опосредующими антителозависимую клеточную цитотоксичность, и цитотоксическими Т-лимфоцитами (Bologncst D. Р., 1990]. Значительный интерес представляет факт наличия в некоторых областях оболочки HIV доминантных иммуногенных эпитопов. С участками оболочки HIV связывается способность вируса к проявлению инфекционное™. Анализ тонкой структуры гипервариабельных участков свидетельствует, что не все из них вариабельны и в некоторых местах они строго консервативны. Естественно, выяснение структурно-функциональных взаимоотношений вариабельных и консервативных участков поможет раскрытию механизма связывания HIV с клеткой-мишенью. Показано, что тропизм к определенному хозяину и цитопатогенное действие (ЦПД) обусловливает ген оболочки. Например, обнаружено, что фрапиент EcoRl/Sspl, содержащий 455 аминокислотных остатков N-конца молекулы gpl20, очевидно, контролирует инфекцию перевиваемых линий Т-клеток (Shioda Т. et al., 1990]. В то же время, учитывая антигенное сходство gpl20 с некогорыми лимфоцитарными структурами (в том числе с рядом антигенов МНС класса II), предполагают, что этот белок может выступать в качестве провоцирующего агента для запуска антихелпер- ного аутоиммунною процесса (Ezzell С., 1991]. С этой позиции объясняют также фатальную депрессию иммунных функций, которая имеет место при вирусном поражении значительной доли популяции Т-хелперов.
Экспрессия с HIV/LTR регулируется клеточными факторами в ответ на активацию Т-лимфоцитов, действие цитокинов и дифференцировку макрофагов, т. е. процессов, играющих критическую роль в прогрессе заболевания (Collins М. et al., 1990]. Определен набор белков, способных взаимодействовать с HIV. Один из них NF-kB, связываясь с энхансером LTR, увеличивает вирусную транскрипцию в огвет на различные стимулы. Идентифицирован участок (I—278) LTR, выполняющий функцию негативною регуляторною элемента, удаление которою повышает экспрессию с LTR в клетках Jurkatt. Следовательно, этот участок играет важную роль в поддержании латентною состояния HIV. Внутри данною участка выявлено два основных сайта связывания, с каждым из которых связываются новые белки из Т-лимфоцитов.
Принципиальное отличие HIV от HTLV-I и II состоит в том, что последние вирусы трансформируют Т4-лимфоциты, a HIV их лизирует (Yoshida М., 1983; Yamamoto N., Ninuma Y., 1985; Gallo R. C. et al., 1987; Mann D. L. et al., 1987; Dedcra D. et al., 1989; Montagnier L., 1989; Yip M. T., Chen I. S., 1990; Laspia M. F. et al., 1990; Greene W. C., 1991]. G. The и A. Gessain (1992) представили данные, указывающие на возможность циркуляции вируса HTLV- I в лимфоцитах CD4 в форме провируса. Механизм трансформации клеток
вирусами HTLV-I и II не совсем ясен. Предполагают, что продукт гена х-1ог, белок рх40, активирующий транскрипцию под действием вирусного LTR, необходим для инициации трансформации, поскольку с ним связывают активацию некоторых клеточных онкогенов, включающихся в лейкомогснсз (Fu- jsawa J. et al., 1986; Seiki M. et al., 1986J. Показано, что белок px40 индуцирует экспрессию рецепторов к интерлейкину-2 в норме регулирующеі'О пролиферацию Т-клеток Jlnone J. et al., 1986]. В то же время с усилением свойств опухолевого фенотипа происходит полная утрата зависимости роста этих клеток от интерлейкина-2. Обнаружен и выделен фактор Т-клеточного лейкоза взрослых (ФТЛВ-тиоредоксин), продуцируемый лимфоцитами, трансформированными HTLV-I или вирусом Эпштейна-Барр, который действует как аутокринный ФР и синергичен интерлейкинам-1 и 2 (Wakasugi N. et al., 1990].
Полагают, что основная роль HTLV-I и II в трансформации Т-клеток сводится к инициаторной функции, а поддержание опухолевого фенотипа не зависит от их присутствия, поскольку в дальнейшем оно контролируется активированными клеточными онкогенами, т. с., по-видимому, имеет место типичный hit and run-механизм.
Y. Wano и соавт. (1988) установили, что стабильная продукция трансакти- вирующего белка p40*“HTLV-I в клетках линии Jurkatt приводит к активации и значительному увеличению уровня экспрессии специфических клеточных генов, вовлекаемых в процесс роста нормальных Т4-лимфоцитов. Количество таких генов, вероятно, ограничено, и они главным образом представлены гонами, кодирующими а-субъединицу высокоаффинного рецептора для интерлейкина-2 (Тас) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Индукция гена интерлейкина-2 синерготически усиливается митогонами, повышающими уровень цитоплазм этического Са2*. Белок р40их не влияет на другое индуцибельные или конститутивно экспрессируемые Т- клсточные гоны. Авторы считают, что линии клеток, конститутивно экспрессирующих вирусный белок р40*“, могут служить моделью для изучения молекулярной основы его действия и выявления полного спектра клеточных генов, регулируемых этим белком. Получены, в частности, сведения, указывающие на способность рДО1" активировать протоонкогон c-fos [Nagata К. et al., 1989].*
Использовав биологочески активные и дефектные провирусы с участком env-px — З’-LTR (кодирует три белка — Tax, Rex и р24), клонированного из клеток Т-клеточного лейкоза взрослых, A. Tanaka и соавт. (1990) в тесте трансфекции обнаружили ростстимулирующую активность гона Тах. Причем при введении в клетки крыс Rat-І этот ген индуцировал проявление туморогенных свойств при последующей трансплантации этих клеток бестимусньгм мышам. Следовательно, ген Тах, не имеющий клеточного аналога и трансак- тивирующий транскрипцию, является онкогеном. Трансформирующая активность этого гена, очевидно, осуществляется путем транскрипционного разрегулирования механизмов контроля клеточного рос^а.
К трансдействующим ретровирусам относится и близкородственный лим- фотропным вирусам человека вирус бычьего лейкоза (BLV), вызывающий В- клеточный лейкоз и реже — Т-клеточные лимфомы. Экспрессия генов вирусов подобного рода четко регулируется на множестве уровней, включая транскрипционный контроль, осуществляемый кодируемыми вирусом транс-дсй-
ствующими специфическими белками и цис-действующими последовательностями-мишенями JDerse D , 1987; Williams J. С. et al., 1989J.
III. Слабоонкогенныевирусыне содержат клеточных онкогенов, обычно компетентны по решіикации, размножаются в культурах клеток без видимых изменений и вызывают у некоторых чувствительных животных при длительном латентном периоде (иногда больше года) главным образом лимфоцитарные лейкозы. Основу этой группы составляют вирусы лейкоза птиц (ALV) и мышей (Gr-MuLV, MoMuLV идр.). Механизм трансформирующего действия данных вирусов обусловливается, с одной стороны, функционированием их трансформирующих последовательностей, а также их способностью активировать клеточные онкогены, а с другой — способностью образовывать в результате рекомбинаций с клеточным геномом экзогенный опухолеродный вирус. Показано, что место интеграции ретровируса может обусловливать определенный тип бластом атозного процесса. Например, слабоонкогенный вирус лейкоза птиц RAV-1 вызывает разные неоплазии (лимфомы или эритробластозы), активируя различные клеточные онкогены (соответственно myc и егЬВ) путем инсерции своего LTR. Последовательность последнего оказалась практически идентичной последовательности LTR RSV |Fung Y. К. et al., 1983J. В то же время другой слабоонкогенный близкородственный вирус лейкоза птиц RAV-2, интеїрируя вблизи онкогена myc, индуцирует только В-клеточный лейкоз.
Создается впечатление, что структура многих тус-ассоциированных вирусов изменена за счет делении и дефектность провируса вследствие этого играет важную роль в онкогенезе. .Обнаружено, что все тус-ассоциирован- ные провирусы в 21 независимой опухоли содержали делении, которые были локализованы в вирусном геноме и не распространялись на прилежащие клеточные последовательности [Goodenow М. М. Hayward W. S., 1987]. Деле- ции не беспорядочны и примерно в 85% случаев у тус-ассоциированных провирусов определялись в области около 5’-конца вирусного генома, где, вероятно, расположены элементы контроля экспрессии вирусных генов. Второй класс делении, затрагивающий акцепторный участок сплайсинга, который участвует в образовании вирусной env-мРНК, локализован в З'-положе- нии вирусного генома. 3'- и 5'-участки LTR тус-ассоциированных провирусов нс участвуют в экспрессии как и5-тус-транскриптов, так и стабильных вирусных РНК. Следует обратить внимание на то, что организация делегированных провирусов сходна с организацией делегированных неинтегрированных молекул вирусных ДНК. Это подтверждает модель, согласно которой делении происходят до интеграции провируса.
С помощью рекомбинантного ретровируса EU8 была продемонстрирована инсерционная активация протоонкогена c-myb под действием ALV, приводящая к индукции В-клеточных лимфом, а не миелоидных лейкозов [Kant- сг М. R. et al., 1988]. Во всех изученных опухолях вирус EU8 интегрировал вблизи гена c-myb и никогда — гена c-myc. Обычно интеграция происходила ниже сайта инициации c-myb, что приводило к образованию укороченных продуктов. В некоторых случаях EU8 интегрировал непосредственно перед кодирующей областью c-myb. Выявлены три мишени для интеїрации ALV в протоонкогены c-myb и c-myc и в локус c-bic [Clurman В. Е., Hayward W. S., 1989]. Гены c-myb и c-myc связаны с различными фенотипами лимфомы. Локус c-bic служит мишенью для интеграции в одном классе лимфом, обычно в сочетании с активацией протоонкогена c-myc. Представленные факты сви-
детельству» • что гены с-тус и с-bic моїуг действовать синергично в период лимфогенсх» и ген c-bic вовлекается в поздние стадии опухолевой прогрсс- сии.
Считаю і, что активация определенного клеточного гена (пока неизвестного) внутри локуса int-І или int-2 провирусом либо его LTR является необходимым этапом канцерогенеза опухолей молочных желез, индуцированного MMTV. Во всяком случае показано, что экспрессия int-І в клетках молочной железы обусловливает лишь частичную трансформацию [Brown A. ct al , 19861- В качестве отрицательного контроля в этих экспериментах использованы о'ч int-І, несущий мутацию со сдвигом рамки считывания. Установлено, что ген i.it-І кодирует цистеинобогащенный белок со свойствами секретирующего фактора, который экспрессируется в процессе нейрогенеза у мышей и во «взрослом» яичке (Nusse R. et al., 1989J. Предполагают, что этот белок вызывает аномалии в дифференцировке в тех тканях, где он экспрессируется. Был клонирован новый высококонсервативный в эволюции ген int-4, экспрессирующийся при эмбриогенезе в определенные временные интервалы в специфических участках. Обнаружена инсерционная мутация локусов int-І и int-2 вирусом опухолей молочных желез мышей в предраковых поражениях и злокачественных опухолях мышей линии GR [Morris D. W. et al., 19901. Чаще всего вирусный геном MMTV интегрирован в 5 локусов ДНК опухолевых клеток мыши: wint-1, int-2, int-3, wint-З и hst-K-FGF [Callahan R. ct al., 1991).
При индукции лейкозов у мышей вирусом Mo-MuLV, провирус которого встраивается в Mlvi-І- и Mlvi-2-участки хромосом, очевидно, имеет место механизм, аналогичный онкогенезу при инфекции MMTV.
При возникновении экзогенных вирусов лейкоза мышей прежде всего следует, что родительские клетки представляют собой нспсрмиссивную систему для размножения эндогенных MuLV. Вместе с тем гомологичные гены MuLV различной тропности широко комплементируют, вследствие чего с высокой эффективностью образуются патогенные рекомбинанты, часть из которых лейкозогенна. Все эти возникающие рекомбинантные ретровирусы имеют клональное происхождение. Важно, что лейкозогенные рекомбинантные MuLV, как правило, образуются только в результате рекомбинации в предшественниках лимфоидных клеток, содержащих интегрированные провирусы разной тропности. Обнаружена обратная связь между частотой возникновения рекомбинантных MuLV и эффективностью работы клеточных контролирующих механизмов. Экзогенные лейкозогенные В-тропныс MuLV образуются из N-тропных эндогенных непатогенных вирусов в два этапа: сначала вирус «адаптируется» и может размножаться в непермиссивной системе, а затем отбираются лейкозогенные варианты. Изменение тропности MuLV обусловливается модификацией части последовательностей гена env, а для приобретения лейкозогенных потенций необходимы изменения в 113-области LTR
Установлено, что высоким онкогенным потенциалом обладают рекомбинаты, несущие Kpnl-фрагмент генома Gr-MuLV, который включает в себя левый конец ієна env, кодирующего часть gp7(), полный полипептид р15Е и длинный концевой повтор LTR. Следовательно, онкогенностъ ассоциирована с участком, включающим правую часть гена env и часть иЗ-области LTR [Dcs Groseillers L. et al., 1983; Quint W. et al., 1984]. Показано, что транскрипционные сигналы в этой области (U3) могут контролировать специфичность (тип) заболеваний, индуцируемых MuLV [Chads Р. et al., 1983; Koch W et al , 1984) Например, известно, что LTR вируса Френд, образующего фокусы на
клетках легкого норки (Fr-MCF), индуцирует развитие эритроидного лейкоза, a LTR Mo-MuLV —лимфоидного. С помощью методов генной инженерии A. Ishimoto и соавт. (1987) установили, что развитие лимфолейкозов коррелируете присутствием энхансера Mo-MuLV. Последовательность слева и ТАТА-последовательность не существенны для типа лейкоза. Вместе с тем последовательности справа от энхансера различаются у Fr-MCF и Mo-MuLV и специфичны для лейкоза каждою типа. Комбинируя последовательности Fr-MCF и Mo-MuLV, можно создать вирус, способный трансформировать как лимфоидные, так и эритроидные клетки. Аналогичные данные были представлены Н. J. Thiesen и соавт. (1988).
Таким образом, удалось определить элементы геномов ретровирусов Френд и Молони, ответственные за различную тканевую специфичность. Кроме того, показано, что разные типы патологических нарушений, индуцированных эндогенными MuLV, ассоциированы с основным гликопротеином оболочек вирионов — gp7(). Этот белок определяет и способность вируса размножаться в клетках животных разных видов. Причем механизмы индукции лейкозов одним и тем же вирусом в различных клеточных системах моїут быть неодинаковыми.
Методами генной инженерии установлено, что гоны gag и рої MuLV, в частности вируса эритролейкоза Френд, играют существенную роль в лейко- могенезе, поскольку последовательности этих гонов могут превращать неонкогенный вирус в онкогенный и усиливать патогенность вирусов, которые уже лейкомогенны (Oliff A. et al., 1985].
IV. Полноценные и дефектные неонкогенные ретровирусы (и большинство эндогенных вирусов). Следует помнить, что неонкогенные ретровирусы иногда могут внезапно приобретать онкоген- ность, рекомбинируя между собой или с онкогенными вирусами. В частности, они могут рекомбинировать с эндогенными ретровирусными последовательностями, представленными в клеточном геноме либо полноразмерными, либо редуцированными провирусами (Leib-M6sch С. et al., 1990; Ono М., 1990]. Например, семейство RTVL-H эндогенных рстровирусоподобных элементов генома человека состоит из 1000 полноразмерных элементов и такого же количества RTVL-H-родственных LTR (Maer D. L. 1989, 1990].
Рекомбинационные акты, вероятно, представляют собой основной механизм приобретения эндогенным вирусом бластомогонных свойств. Кстати, в геноме кур, как свидетельствуют экспериментальные данные, по-видимому, отсутствуют эндогенные ретровирусные последовательности, рекомбинации с которыми могли бы превратить эндогенный RAV-0 в онкогенный вирус. Однако в естественных условиях такой механизм возникновения высокоонкогенного эндогенного вируса существует у мышей линии AKR и С58. При развитии спонтанного лейкоза у этих животных эндогенный AKR в первые 6 мес постнатального периода обладает очень слабой лейкозогенностью, и для его превращения в высокоонкогенный вирус необходима рекомбинация с ксенотропным вирусом [Elder J. Н. et al., 1977; Dcs Grosciller L. et al., 1983]. Считают, что такие рекомбинации между эко- и ксенотропным и вирусами играют ключевую роль в образовании высоколейкозных штаммов. Вместе с тем следует напомнить, что среди мышей низкораковых линий активная экспрессия ксенотропного вируса происходит только у особей линии NIH Swiss, в геноме которых отсутствует полноценный локус экотропного вируса.
Следует обратить внимание на то, что большинство эндогенных вирусов,
активированных различными способами, непатогенно или даже неинфскци- онно для родительскою организма. Онкогенными и инфекционными свойствами обладают только эндогенные вирусы, выделенные из клеток мышеи высоколейкозных и высокораковых линий, т. с. из клеток искусственно селекционированных по этим признакам животных. Все эти вирусы (MuLV и MMTV) экотропные, т. с. репродуцируются в клетках хозяина и поэтому способны к горизонтальной передаче. Следовательно, нельзя исключить, что свойство трансформировать клетки приобретается ими в процессе экзогенной инфекции. Однако высокоонкогенные вирусы сарком, как правило, дефектны, и для их репликации требуется вирус-помощник. Исследуя экспрессию эндогенной вирусной информации в различных линиях клеток крыс в сравнительном аспекте, Е. М. Scolnick и соавт. (1976) пришли к заключению, что в генезе вирусов сарком существенная роль принадлежит вирусам-помощникам. По мнению авторов, первый этап этою процесса состоит во включении экспрессированных саркомоспецифических последовательностей РНК в частицы вируса-помощника. Эффективная трансмиссия саркомоспе- цнфической РНК требует дополнительных процессов. И, наконец, образование стабильною вируса сарком путем рекомбинации между геномом вируса- помощника и частью саркомоспсцифической РНК является процессом значительно более редким, чем обычное «спасение» вируса.
На модели эндогенного вируса MMTV была установлена прямая корреляция между уровнем экспрессии сю генома и спонтанным канцерогенезом (появлением опухолей молочных желез мышей), а также ускоренной индукцией (канцерогенами и гормонами) этих новообразований на фоне активной продукции эндогенною MMTV [Michalides R. et al., 1979]. Однако индуцировать синтез эндогенною MMTV из клеток опухолей молочных желез и клеток гиперпластических альвеолярных узелков (ирснсопластичсские образования молочной железы при «гормональном» канцерогенезе) намного легче, чем из нормальных клеток молочной железы [Me Grath С. М. et al., 1978].
Важно отмстить, что в геноме опухолевых клеток происходит амплификация эндогенных провирусов MMTV, т. с. обнаруживаются дополнительные локусы интеграции эндогенных провирусов в уникальном для каждой опухоли участке ДНК. Причем эндогенный провирус мышей линии GR в локусе Mtv-2 определяет продукцию эндогенного вируса в молоке. Существенно, что большинство нзолятов эндогенных MMTV бластомогснно в экспериментальных условиях, однако они наименее патогенны для мышей родительской линии [Long С. ct al., 1980]. При введении эндогенною MMTV мышам чувствительных линий этот вирус индуцирует образование гиперпластических альвеолярных узелков. Вирус GR вызывает развитие юрмонозависимых бляшек в молочной железе; клетки бляшек пролиферируют во время лактации (гормональная стимуляция). Затем внутри этих бляшек формируются клоны юрмонозависимых злокачественных клеток [Bcntvclzen Р., 1972].
Нсонкогенные ретровирусы, хотя и размножаются значительно хуже онкогенных, все же потенциально могут инициировать онкогенез, используя механизм активации экспрессии клеточных онкогенов. Этот гцюцесс может осуществляться двумя путями: ретровирусы включают в свой геном онкоген и в последующем он может попадать под контроль клеточною промотора либо ретровирусы подключают свой LTR к клеточному онкогену. Надо полагать, что проретровирусы вообще могут изменять активность нс только онкогенов,
но, вероятно, и других клеточных генов. Поэтому их можно рассматривать как модуляторы широкого спектра действия.
В исследованиях последних лет убедительно показано, что наличие в цикле репликации ретровирусов сталии ДНК-провируса позволяет им выполнять разнообразные функции и обладать многими биологическими свойствами. Они являются агентами с разными патологическими потенциями, распространены среди многих видов и передаются как горизонтально, так и вертикально. Ретровирусы — особые паразиты, они хорошо адаптированы к функциям хозяина: обеспечивают интеграцию, экспрессию вирусного генома и определенную кооперацию с клеточными структурами. Сами по себе они являются интермедиатами в популяции ДНК-провирусов — структурных гомологов транспозонов других организмов. Как мутагены они могут прерывать, модифицировать или активировать клеточные гены, встраиваясь в различные участки клеточной ДНК; при этом в хозяйской ДНК появляются новые элементы, которые, как правило, стабильно наследуются.
Кроме того, ретровирусы, так же как и ДНК-содержащие опухолеродные вирусы, обладают регуляторным действием, которое осуществляется по трансмеханизму на транскрипционном уровне, а не в результате интеграции в соседстве с определенными клеточными генами. Например, Mo-MuLV и Mo- MSV изменяют экспрессию генов I класса гистосовместимости мышей (МНС) и Р2-макроглобулина. Вследствие таких модуляций, в частности, резко увеличивается количество белков H-2D, Н-2К и H-2L на клеточной поверхности, причем оказалось, что коинфекция этих клеток Mo-MSV отменяла эффект увеличения экспрессии генов МНС, обусловленный Mo-MuLV JWilson L. D. et al., 1987]. Понятно, что при этом происходят и резкие изменения в иммуно- химическом узнавании данных клеток. В качестве векторов ретровирусы способны трансдуцировать клеточные гены и функционировать как потенциальные агенты эволюционных изменений; при этом рекомбинации вирусного и клеточного геномов могут приводить к появлению дефектных рекомбинантных вирусов.
Следовательно, ретровирусы могут обусловливать генетический полиморфизм и генетическую нестабильность в популяции инфицированных клеток, функционировать в качестве модуляторов геной активности, индуцировать амплификацию генов, переносить хозяйские гены и вызывать инсерциоиные мутации, т. с. они являются активными факторами изменчивости соматических клеток. Все перечисленные свойства ретровирусов были выявлены при изучении различных трансформированных клеток, служащих естественными моделями измененных соматических клеток. Вероятно, онкогенез — это лишь один из вариантов взаимодействия ретровирусов с клеткой и, возможно, данные вирусы играют важную роль в изменчивости в процессе эволюции. 3 свете обсуждаемых вопросов особый интерес представляют эндогенные провирусы (ретровирусные генетические элементы), являющиеся частью генома нормальных клеток большинства позвоночных, в хромосомах которых они обнаруживаются в виде множественных копий. Анализ структуры хроматина, метилирования и транскрипции этих эндогенных провирусов свидетельствует о том, что экспрессия их геномов находится под таким же контролем, как и других клеточных генов (Jaemisch R., 1983]. Предполагают, что новые локусы эндогенных провирусных последовательностей образуются либо при реинфекции вирусом клеток зародышевой линии, либо в результате транспозиции «старых» эндогенных последовательностей.
Итак, основные события (в сложной последовательной цепи и/или каскаде), происходящие в процессе вирусного канцерогенеза, следующие: 1) экспрессия вносимых вирусных онкогенов; 2) изменение экспрессии клеточных генов, в том числе протоонкогенов, антионкогенов и генов эффекторов трансформации с помощью цис- и транс-механизма на транскрипционном уровне, а также путем подключения вирусных регуляторных последовательностей или активации провирусами клеточных промоторов, или вследствие значительных хромосомных перестроек, главным образом транслокаций, делений и амплификаций; 3) индукции еще нс идентифицированных генетических изменений, приводящих к опухолевой трансформации клеток. В частности, представлены факты, свидетельствующие о том, что аденовирусы человека типов 2 и 12, так же как и вирусы группы герпеса, оспы и другие ДНК-повреждающие агенты, способны вызывать селективную амплификацию ДНК (в том числе и интегрированных последовательностей вирусов гепатита В, папилломавирусов крупного рогатого скота и др.) в дополнение к ранее известному мутагенному действию и эффекту повреждения хромосом jSchlehofer J. R., Hausen Н., 1990).
В совокупности все эти многообразные и случайные по своей природе изменения приводят к структурно-функциональным нарушениям и определенным формам совместного взаимодействия вирусных и клеточных продук тов. Однако опухоль, вероятно, возникает только тогда, когда происходит перепрограммирование клеточного генома, т. е. репрессируется тканеспецифическая программа (утрачивается контроль «созревания» и т. д.). Путем селекции таких клеток формируется стабильный опухолевый фенотип, в котором реализуется большая часть эмбриоспецифической программы и начинает функционировать механизм иммунологического распознавания своих собственных эмбриональных поверхностных антигенов (ЭПА-10). При этом всегда происходят различные рекомбинации геномов опухолсродных вирусов с геномами как других вирусов, так и клетки. Эта особенно ярко выраженная способность ретровирусов приводит к возникновению новых онкогенных межвирусных рекомбинантов, например вирусов типа группы MCF у мышей.
Исходя из принципиально различных механизмов бластомогенного действия опухолсродных вирусов на клетку, они могут быть сгруппированы следующим образом.
1. Вирусы, содержащие онкогены как иммортализации, так и трансфор мации, т. е. интеграция этих экзогенных генов в клеточный геном необходима и достаточна (при взаимодействии с регуляторными клеточными структурами) не только для индукции неопластической трансформации, но и для ее поддержания. К таким вирусам относятся, например, вирусы группы полиомы и аденовирусы.
2. Вирусы, которые, помимо экзогенного клеточного онкогена, инициирующего определенную стадию онкогенеза при интеграции его в хромосомную ДНК, вовлекают в этот процесс и другие клеточные онкогены, антионкогены и гены — эффекторы грансформации. Примером могут служить ретровирусы, онкобелки которых являются протеинкиназами, регуляторами аденилат- циклазы, аналогами ФР или их рецепторами и т. д.; локазизуются они в ядре, в цитоплазме или на клеточных мембранах.
3. Вирусы, вызывающие трансформацию по типу сложного каскадного hit-and-run-механизма с включением в онкогенез клеточных онкогенов, антионкогенов и генов — эффекторов трансформации, причем в большинстве
случаев вирусные трансформирующие последовательности (неклеточнои природы), промоторы и прочие элементы, запустившие процесс онкогенеза, мо- іут элиминироваться из клеток, поскольку они уже, как правило, не нужны для поддержания трансформированною фенотипа. Классическим примером является семейство герпесвирусов, представители которою обусловливают опухолевую трансформацию с помощью указанного механизма. Стабильная интеграция всею вирусною генома при этом варианте нс обязательна, поскольку вирусная ДНК необходима для инициации, но не для поддержания трансформированного фенотипа. Аналогичным механизмом трансформирующего действия, вероятно, обладают папилломавирусы человека и крупного рогатого скота [Smith К. Т., Campo М. S., 1988]. В частности, показано, что белки Е6 и Е7 вируса папилломы человека (HPV16) кооперативно имморта- лизуют кератиноциты крайней плоти человека, а продукт гена Е7 того же вируса, кооперируясь с онкобелком онкогена ras, вызывает трансформацию первично трипсинизированных клеток грызунов. Установлено, что точечные мутации в гене Е7 HPV16 влияют на трансформацию, кооперацию с геном ras, трансактивацию и фосфорилирование белка Е7 [Hawley-Nelson Р. et al., 1989; Chesters Р. М. et al., 1990; Storey A. et al., 1990; Halbert C. L et al, 1991 ]. Котрансфекция антионкогена p53 (мышиным или человеческим диким типом) с Е7 и онкогеном ras заметно снижала трансформацию клеток, но нс влияла на способность трансформировать мышиную клеточную линию к независимому от закрепления росту [Crook Т. et al., 1991 [. Напротив, экспрессия мутантного р53 сильно потенциировала трансформирующую функцию Е7 человеческого полиомавируса типа 16 и обеспечивала заметную независимость ФР в клетках, сотрансфсцированых Е7 и ras. Полагают, что представленные факты свидетельствуют о раздельном функционировании Е7 и р53, тем не менее комплементарными биохимическими путями. Показано также, что и белки Е6 нолимомавирусов человека серотипов 16 и 18 способны связываться и формировать комплексы с р53 и эта активность коррелиро вала у Е6 различных вирусов папиллом человека с их отношением к клини чсским заболеваниям in vivo и трансформирующей пегонцией in vitro [Wer- ncss R. A. et al., 1990].
Осуществлен химический синтез полноразмерного полипептида Е7 из у/ аминокислотных остатков. Он был биологически активен и содержал как минимум два автономных функциональных домена: для индукции синтеза клеточной ДНК и для трансактивации [Rawals J. A. et al., 19901. Оказалось, что гоны Е6 и Е7 вируса папилломы человека типа 18 (HPV18) также достаточны для индукции двухэтапной трансформации in vitro кератиноцитов человека (Barbosa М. S., Schlegel R., 1989]. Трансформированные кератикоцн- ты экспрессировали мажорный ранний вирусный белок Е7, однако опухолей у бестимусных мышей не вызывали.
Определена последовательность (LCR—Е6—Е7), обусловливающая различия в трансформирующей активности между HPV16 и HPV18 [Villa L. L., Schlegel R., 1991 ]. Отдельные изоляты HPV16 и HPV18 могут иметь различия в трансформирующем потенциале при выделении их из разных анатомических участков. Установлено, что у белка Е7, кодируемого рамкой генома Е7 папилломавирусов человека типов 6, 16 и 18, имеется участок из 1 7 амино кислотных остатков, высокогомологичный аденовирусному белку Е1А и большому Т-антигену вируса SV40. Этот участок содержит сепаративные домены для связывания с клеточным белком гена ретинобластомы РЫ и для фосфо-
рилирования казеинкиназой II (Barbosa М. S. et al., 1990; Jones R. E et al , 1990; Hollingsworth R. E., Lee W. H., 1991 J. Причем эти два процесса являются ключевым звеном онкогенного потенциала данных вирусов. В свою очередь обнаружено, что облаегь продукта гена РЫ восприимчивости к ретинобластоме между остатками 379 и 792 необходима и достаточна для связывания и образования комплексов с большим Т-антигеном SV40 или с белками Е1А аденовирусов (Huang S. et al., 1990; Kaelin W. et al., 1990]. Эта область содержит уникальную структурную информацию, достаточную для тот, чтобы определять различие между большими Т-антигенами SV40 дикот типа и дефектного по трансформации мутанта К1. Существенно, что белки Е7 неонкогенного папилломавируса человека типа 6b(HPV6b) и опухолсродного HPV16 различаются по связыванию с белком ретинобластомы и по другим свойствам (Gage J. R. et al., 1990].
Показано, что для иммортализации нормальных эпителиальных клеток молочной железы человека и снижения их потребности в ФР достаточно экспрессии одной копии HPV16 или HPV18, интегрированных в их гоном (Band V. et al., 1990].
М Durst и соавт. (1989) предложили многоступенчатую модель канцерогенеза эпителиальных клеток in vitro, согласно которой эпидермальные кера- тиноциты человека подвергаются иммортализации после трансфекции ДНК HPV16, однако такие клетки не являются туморогонными. Эти эпителиальные клетки, иммортилизированные папилломавирусами, имели характеристики предмалигнизации в органотипической культуре (Blanton R. ct al., 1991 ]. Неопластическая трансформация этих культур происходит после заражения их вирусом саркомы Кирстен, содержащего активированный онкоген Ki-ras. Эффективность опухолевой трансформации под действием ras возрастает в 125 раз при обработке этих клеток гликокортикоидами.
Определена также кооперация между папилломавирусами крупного рогатого скота типа 4 и ras при морфологической трансформации первичных фибробластов крупного рогатого скота (Jaggar R. Т. et al., 1990]. Субгсном- ный фрагмент, содержащий полные Е7 и Е8 открытые рамки считывания, индуцировал трансформацию при кооперации с активированным ras. Трансформация была более активна, когда эти рамки находились под транскрипционным контролем длинного концевого повтора Mo-MuLV. Это свидетельствует о том, что степень трансформации зависит от уровня экспрессии данных генов.
Наконец, обнаружено, что опухолевые клетки, продуцирующие нуклеоп- ротеид Е7 HPV16, в результате трансфекции или естественным путем (в случаях многих карцином человека) могут индуцировать опухолеспецифический отторгающий эффект и служить мишенью для такого ответа (Chen L. et al., 1991 ]. Авторы считают, что эта модель может использоваться на животных, с одной стороны, для исследования иммунных ответов на трансформированные HPV клетки, а с другой —для оценки эффективности антипапил- ломатозных вакцин при терапии и предупреждении подобных опухолей.
Важно заметить, что наряду с уже описанными у герпесвирусов трансформирующими последовательностями у вируса простого герпеса типа 2 (HSV 2) и цитомегаловируса идентифицированы трансформирующие области из 737 и 490 пар оснований, составляющие около 0,5% генома (Агеенко А. И., 1986; Spriggs D. R. et al., 1986; Buonaguro F. M. et al., 1987]. Эти сегменты не содержали открытых рамок считывания и не образовывали белковых продук-
гов. По данным секвенирования, определенная часть этих последовательностей имеет структуру, аналогичную инсерционным элементам типа 1S, принадлежащим к мобильным генам. Известно, что такие генетические структуры могут функционировать в качестве инсерционных мутагенов, активируя или модифицируя транскрипцию определенных клеточных генов, и в то же время выполнять функции усилителей транскрипции других генов, в частности протоонкогенов или генов эффекторов трансформации. Понятно, что иногда конечным результатом такой активации и модификации клеточных генов может быть опухолевая трансформация. Показано, что минимальный трансформирующий фрагмент HSV 2 mtr может действовать как комплексный промоторный элемент, а концевые сегменты EJ и ЕМ трансформирующей области Xbal-E цитомегаловируса человека способны индуцировать опухолевую трансформацию иммортализованных клеток |Jones С., 1989; Juriwalla R. J. et al., 1989).
Что касается вируса Эпштейна-Барр (EBV), то в его геноме определен фрагмент BARF1 внутри сегмента Bam HIA, белок (латентный мембранный белок — Л МБ) которого, как считают авторы, играет существенную роль в процессе латентной инфекции и злокачественной трансформации В-лимфоцитов, а также является фактором регуляции синтеза белка на уровне трансляции [Pfrzner A. et al., 1987). Затем М. X. Wei и Т. Оока (1989) показали, что трансфекция онкогена BARF1 в фибробласты мыши приводит к их стабильной неопластической трансформации: при инъекции новорожденным крысам трансформированные клетки инициировали образование опухолей. Методом ДНК-блот-гибридизации установлено наличие в клетках этих опухолей гена BARF1 и методом иммуноблоттинга с применением человеческой NPC-сыворотки в этих клетках выявлена экспрессия белка с молекулярной массой ЗЗООО — раннего полипептида вируса, кодируемого геном BARF1. Получены также данные, свидетельствующие о том, что ядерный белок EBNA- 2EBV является ключевым в трансформации В-лимфоцитов [Cohen J. I. et al.,
1989) . Молекулярный анализ онкогена BARF1 показал, что интрацитоплаз- матичсский домен белка ЛМБ подвергается множественным мутациям, которые могут изменять трансформирующую способность этого онкогена ггри болезни Ходжкина [Knecht Н. et al., 1992). Следует отметить, что канцерогенез, индуцированный этим вирусом, представляет собой многт>факторный процесс, ассоциированный с активацией клеточных протоонкогенов Ha-ras, fgr, myc и др. [Arrand J. R. et al., 1988). В частности, показано, что продукт гена EBNA-2EBV вызывает индукцию протоонкогена c-fgr и, возможно, белок этого гена активно участвует в иммортализации В-клеток [Knutson J. С.,
1990) .
Необходимо отметить, что, очевидно, hit-and-run-механизм в той или иной мере используется многими опухолеродными вирусами. Например, С. Chau- vin и соавт. (1990) с помощью метода Саузерн-блот-анализа исследовали опухоли мозга крыс и человека на наличие последовательностей ДНК трех групп вирусов (HSV1, SV40 и аденовируса человека типа 2). Ни в одном случае (39 опухолей) этих последовательностей не обнаружили. Полученные данные свидетельствуют о том, что указанные вирусы либо нс играют никакой роли в индукции этих новообразований, либо действуют по hit-and-run- механизму, либо вирусные последовательности распределены по клеточному геному в виде мелких дисперсных фрагментов, которые не удается выявить с помощью указанного метода.
4. Ретровирусы и ДНК-содержащие оиухол с родные вирусы, в частности гепадновирусы, индуцируют, вероятно, опухолевую трансформацию по тину hit-and-run-механизма, но не содержат трансформирующих областей, т. е. собственно онкогена JZahm Р., Hofschncider Р. Н., 1987). Считают, что ДНК вируса гепатита В, интсірируя в клеточный геном, активируют в основном протоонкогены семейства myc, поскольку вовлечение других клеточных генов обнаруживается значительно реже в клетках рака печени человека JBucn- dia М. А., 1991]. Показано, что определенные гены вирусов этой группы являются представителями семейства трансактиваторов. Например, ген X вируса гепатита В способен стимулировать промоторы полимеразы II и III, а также длинные терминальные повторы HIV-1 и HIV-2 JAnfiero В., Schmcidcr R. J., 1990; Levreo М. et al., 1990).
Следует особи подчеркнуть, что существенная роль в опухолевой трансформации клеток, возникшей под действием опухолеродного вируса, как установлено, принадлежит мутациям клеточного генома по типу вставки (при интеграции провируса с хромосомной ДНК), а также активации протоонкогенов и клеточных промоторов, изменяющих, в частности, активность клеточных генов эффекторов трансформации и антионкогенов. Все эти факты означают, что значение опухолеродных вирусов в онкогенезе не оіраничива- ется только проявлением активности продуктов вносимого ими онкогена. Основная особенность их взаимодействия с клеткой заключается в том, что они, как правило, нс вызывают гибели кістки, а изменяют генетически, внедряя свой геном в хромосомную клеточную ДНК и кооперируя с определенными регуляторными клеточными структурами и белковыми продуктами. Если провирусная ДНК интегрирует с геномом герминальных клеток, то генетические изменения могут затрагивать весь организм в целом и в некоторых случаях при этом могут возникать эндогенные вирусы. Главная особенность провирусной ДНК опухолеродных вирусов состоит в том, что она обладает способностью интегрировать с различными областями клеточного генома. Иными словами, при инфекции опухолеродным вирусом практически каждая клетка становится новым вариантом генетического взаимодействия.
Известно, что все опухолеродные вирусы являются модуляторами иммунного ответа на неопластически трансформированые клетки. Это, естественно, способствует формированию опухолевого узла в организме (см. главу 3).
На основании результатов детального анализа ts-мутантов вирусов полиомы (PY) и SV40, а также многочисленных исследований, посвященных тестированию функциональной активности генов этих вирусов, можно прийти к заключению, что ранние участки их геномов содержат как иммортализи- рующис, так и трансформирующие онкогены | Агеенко А. И., 1986; Bolen J. В. et al., 1984; Connan G. et al., 1985; Kelly F. et al., 1986; Markland W. et al., 1986; Ito Y., Griffin В. E., 1990; Remenick J., Brady J., 1990).
Ранняя область геномов полиомавирусов кодирует синтез 3 белков: большого (содержит 785 аминокислотных остатков, ММ 90 000—100 000), среднего (соответственно 421, 55 (XX)) Т-антигенов и малого (соответственно 174—195 аминокислот и 15 000—22 000) t-антигена [Magnusson G., 1985; Wilson J. et al., 1986).
С помощью электрофореза в полиакриламидном геле и ионообменной хроматографии с использованием метода фингерпринтирования Т-антигенов вируса PY было показано, что большой и малый Т-антигены имеют 5—7
общих пептидов. Средний и малый Т-антигсны содержат два пептида, которые отсутствуют в большом Т-антигене. Далее было установлено, что большой и малый Т-антигены SV40 обладают одной общей антигенной детерминантой и одной уникальной. С помощью антисывороток, содержащих только антитела против уникальных антигенных детерминант, удалось выявить, что общие антигенные детерминанты локализованы на ЫН2-концах, а уникальные — на С-концах большого и малого Т-антигенов (Greenfield R. S. et al., 1980]. На основании всех представленных данных, можно предположить, что три формы Т-антигена имеют общий МН2-конец, кодируемый в зоне 0,65—0,59 ед. генетической карты SV40, но разные СООН-концы. Уникальный полипептид малого t-антигена кодируется в зоне 0,59—0,54 ед. карты (Martin R. G. ct al., 1979].
Анализ свойств набора Т-антигенов (большого (кодируется геном pit), среднего (кодируется геном pmt) и малого] у различных hr-t-мутантов PY показал, что все три белка также содержат общий 1ЧН2-конец из 79 аминокислотных остатков, а малый и средний Т-антигены имеют 112 общих аминокислотных остатков, относящихся собственно к зоне hr-t (Wilson J. ct al., 1986]. Особое значение имеет последовательность от 8-го до 34-го аминокислотного остатка, которая постоянно присутствует во всех гликопротеид ных гормонах гипофиза и обнаружена также в одном из белков паповавируса человека В К. С этой последовательностью связывают влияние вируса на микрофиламенты цитоскелета и морфологию клетки. Средний Т-антиген отличается от малого тем, что содержит 230 дополнительных аминокислотных остатков. В этой последовательности интерес представляют три основных фрагмента: 1) домен, обогащенный пролином; 2) гидрофобный «хвост», состоящий из 22 остатков и выполняющий функции «мембранною якоря»; 3) два блока кислых аминокислотных остатков, фланкирующих гидрофобный домен.
Т. Hunter и соавт. (1980), использовав экспериментальные и теоретические разработки, составили схему, согласно которой три ранних антигена вируса PY кодируются перекрывающимися последовательностями ДНК вируса PY. Все три белка имеют общую Ь4Н2-концевую часть (80 аминокислотных остатков), колируемую в области 74—79 ед. карты. Малый и средний Т- антигены, кроме тою, имеют 120 общих остатков, кодируемых в области 79—85 ед. карты, которых нет в большом Т-антигене. С-концевая часть среднею Т-антигсна, состоящая из 230 остатков, картируется между 86 и 99 ед. карты. Остальная часть большого Т-антигена кодируется между 86 и 25 ед. карты, перекрываясь с С-концевой областью среднею Т-антигена.
Большие Т-антигены вирусов PY и SV4O являются ДНК-связывающими мультифункциональными фосфобелками и более чем на 95% локализуются в ядре клетки; менее 5% белков находится на клеточной поверхности в ассоциации с плазматической мембраной. В ядре клетки различают нуклсоплазма- тический, хроматинсвязанный и ассоциированный с ящерным матриксом большой Т-антиген (главным образом, гликозилированный). На плазматической мембране содержится NP4O-растворимый и NP40-нерастворимый большой Т-антиген SV40 (Schmitt М. К., Mann К., 1987].
С помощью МАТ против большою Т-антигена SV40 определены подгруппы антигенных детерминант на поверхности клеток, трансформированных SV4O (Ball R. К. et al., 1982]. Затем методом иммунофлюоресценции на поверхности клеток, трансформированных SV40, М. Santos и J. S. Butel (1982) идентифицировали три основных антигена: Т-антиген SV40, клеточ-
ный белок с молекулярной массой 53 000 и антигены гистосовместимости I класса (H-2D). Эти белки метили с помощью лактопероксидазного метода, затем проводили иммунопреципитацию. Авторам удалось показать, что Т- антиген на поверхности исследованных клеток находится в комплексе с указанным белком. Комплексы Н2-Т-антиген, устойчивые к действию детергентов, не обнаружены. МАТ как против Т-антигена, так и белка с массой 53 000 осаждали комплекс, содержащий оба белка, что свидетельствует об их прочной связи. С помощью МАТ показано, что на поверхности клеток, трансформированных SV40, присутствуют фрагменты как NH2-, так и СООН- коица Т-антигена. Кроме того, обнаружены структурные (или конформанионные) различия поверхностного и ядерного Т-антигенов (Ball R. et al., 1984; Tevcthia S. S. et al., 1989J.
В эксперименте удалось установить, что экспрессия TSTA не зависит от продукции t-антигена. Оказалось, что части Т-антигена SV40 (от NH2-конца до 0,42 ед. карты) достаточно для появления TSTA на поверхности клеток (Tevcthia
S. S. et al., 1983(. Определены сайты узнавания цитотоксическими Т-лимфоци- тами наТ-антигене SV4O: сайт I локализуется между аминокислотными остатками 205—210, сайты II и III — между 220—223 (сайт II может быть отделен от сайта III и локализован между остатками 225—239), сайт IV между остатками 484—503 (Tevethia S. S. ct al., 1989]. Все приведенные факты указывают на то, что ранняя область генома полиомавирусов кодирует белки, содержащие антигенные детерминанты, которые обусловливают реакции клеточного иммунитета, т. е. функционируют в качестве TSTA в ассоциации с антигенами гистосовмсстимости класса I. Причем продукты генов інстосовместимости класса I служат поверх постным и рецепторами для вируса SV40 (Atwood W. J., Norkin L. С., 1989].
Оба больших Т-антигена полиомавирусов химически модифицируются по нескольким направлениям, включающим фосфорилирование (все типы Т- антигенов содержат фосфорные группы) нескольких участков (серина и остатков треонина), N-терминальное ацетилирование, поли-АДФ-рибозилиро- вание, гликозилирование, пальмитирование и аденилирование [Magnusson G., 1985; Butel J., larvis D. L., 1986]. Супермолекулярная структура большого Т-антигена, например SV40, представлена нативной формой, мономерами, димерами, высокогомологичиыми олигомерами и гстсроолигомсрами с р53 или белком Rb с молекулярной массой 105 000 (Butel J., larvis D. L., 1986; Dyson N. et al., 1990; Trifillis P. et al., 1990].
Анализ субклеточной локализации среднего Т-антигена вируса PY (имму- нофлюоресцснция, иммунная электронная микроскопия и применение МАТ) показал, что он ассоциирован с цитоплазматическими мембранами, к которым прикрепляется гидрофобной частью аминокислот, локализующихся на С-концевом участке молекулы белка. На ранних стадиях инфекции основная часть среднего Т-антигена обнаруживается в комплексе с эндоплазматическим ретикулумом. Небольшое количество этого белка выявляется на плазменных мембранах клетки. На поздних этапах инфекции доля среднего Т- антигсна вируса PY на плазменной мембране возрастает (Dilworth S. М., Griffin В. Е., 1983; Magnusson G., 1985]. Малый t-антиген локализуется в ядре клеток (Ito Y. et al., 1986].
Нельзя исключить, что у Т-антигенов полиомавирусов, обладающих плей- отропным действием, функционально активные формы могут различаться но степени фосфорилирования, иными словами, эти белки фосфорилируются
дифференцированно. В пользу этого свидетельствуют следующие факты. 1. Большой Т-антиген фосфорил ирован во многих сайтах, причем обратимо, все фос- фопегттиды различаются по содержанию фосфора. 2. Существует корреляция между уровнем фосфорилирования и олигомеризации T-антигена. 3. Более фосфорил ированный Т-антиген активнее связывается с ДНК, т. е. данный белок фосфорил ирован в клетке в разной степени и это влияет на ею сродство к вирусной ДНК и клеточному хроматину и ДНК [Montcnarh М. et al., 1980; Scheidtmann К. Н. et al., 1982; Mohr I. J. et al., 1986]. Полагают, что фосфорилирование Т-антигенов-инициаторов специфического связывания с ДНК регулирует репликацию ДНК у SV40. Однако фосфорилирование Т-антигсна не требуется для стимуляции синтеза клеточной ДНК [Rawlins D. R. et al., 1983].
Отмечено увеличение фосфорилирования по тирозину среднею Т-антигсна вируса PY под действием эпидермального ФР (ЭФР), что указывает на определенную связь между ними [Segawa К., Ito Y., 1983]. Получены данные, согласно которым фосфорилирование в NH,-конце большого Т-антигена SV40 нс является необходимым для стабильной трансформации клеток [Fischer- Fantuzzi L. et al., 1986]. Оказалось, что и основной сайт (тирозин-315) фосфорилирования в среднем Т-антигене вируса PY также не является необходимым для проявления трансформирующей способности вируса (Mes-Masson А. М. et al., 1984]. В то же время некоторые вирусные протеинкиназы в процессе неопластического перерождения клетки могут функционировать в комплексе с фосфопротсинкиназами — продуктами клеточных онкогенов. Например, обнаружен комплекс среднего Т-антигена вируса PY, обладающий киназной активностью, с ррбОс‘*ге, который, как считают, модифицирует активность и специфичность протеинкиназы рр60с,гс при трансформации клеток этим вирусом [Smith А. Е. et al., 1983; Courtneidyc S. A., Smith A. E., 1984].
АТФазная активность выявлена только у большого Т-антигена полиомавирусов [Clark R. et al., 1981 ]. Она не повышалась в присутствии денатурированной ДНК и снижалась при добавлении сыворотки против Т-антигена. Представлены данные о том, что АТФазная активность Т-антигена SV40 кодируется участком гена A SV40 между 0,37 и 0,29 ед. генетической карлы. Разработан тест определения этой активности с использованием МАТ, существенно нс ингибирующих АТФазную активность Т-аитигсна SV40. С помощью теста можно выявлять низкие уровни Т-антигена в экстрактах клеток, зараженных SV4O. Кроме того, Т-антиген стимулирует включение ,2Р из у-52Р-АТФ в белок [Griffin J. D. et al., 1979; Murphy С. I. et al., 1988]. По результатам электрофореза в полиакриламидном геле субстратом фосфорилирования служит Т-антиген. Кроме того, высокоочищенный Т-антиген стимулировал включение фосфата в экзогенный акцептор — казеин. При многостадийной очистке наблюдались параллельное обогащение препарата Т- антигеном и возрастание активности протеинкиназы, причем при седиментации оба компонента обнаруживались в зоне 6S. Протеинкиназа препарата Т- антигена из ts-мутанта S V40 характеризуется повышенной термолабилыюстью. Следовательно, Т-антиген обладает еще двумя ферментативными активностями — АТФазной и протеин киназной, которые ингибируются сывороткой против Т-антигсна [Hand R., 1981].
В инфицированных и трансформированных SV40 клетках ДНК-полимераза осаждается с основной массой Т-антигсна 5У40-матрикса и копреципи- тируется антисывороткой против Т-антигена [Jones С., Su R. Т., 1982]. Пред-
полагают, что между ассоциированной с матриксом ДНК-полимеразой и Т- антигеном SV4O образуется комплекс.
В настоящее время с ранней областью ДНК полиомавирусов связывают такие функции вирусного генома, как синтез ранних белков, ауторегуляцию экспрессии ранних и поздних генов, инициацию синтеза вирусной ДНК. элонгацию цепей вирусной ДНК при репликации, активацию ферментов клетки, необходимых для ее перехода из стадии покоя в стадию деления, индукцию синтеза клеточной ДНК, инициацию специфической интеграции, блокирование дифференцировки клеток, иммортализацию клеток, индукцию трансформации, изменение поверхности трансформированных клеток и, наконец, поддержание трансформированного фенотипа клеток, который определяет их способность к росту в агаровой среде, потерю контактного торможения, туморогенность и другие свойства опухолевых клеток | Anderson J. L., Martin R. G., 1976; Dulbccco R., 1976; Hiscott J. B., Defendi V., 1981; Chering- ton V. et al., 1987; Murphy С. I. et al., 1988; Lawson R. et al., 19901. Оказалось, что клетки, трансформированные PY и SV40, различаются по фенотипу Использование в этих экспериментах us-мутантов позволило определить, что фенотип трансформации контролируется ранними областями геномов обоих вирусов |РсгЬа1 В., Massouldzadegan М., 1980; Thumml С. S. et al., 1981; Торр W. С., Rifkin D. В., 1981; Treisman R. etl al., 1981].
Исследование разных рекомбинантных плазмид, несущих различные участки геномов полиомавирусов, показало, что большой Т-антигсн обоих указанных выше вирусов может им моргал изировать клетки грызуне | Assclin С., Bastin М., 1985; Glaichenhaus N. et al., 1986; Chen S., Pauch E., >90]. Методами генной инженерии установлено, что биол отчее кая активное ъ, индуцирующая иммортализацию клеток, обоих генов, кодирующих болыь >й Т-антиген полиомавирусов, локализована в первых 137—147 аминокислотных остатках с К’Н2-конца. Эта активность сильно варьировала у различных мутантов вследствие изменений стабильности или конформации редуцированного Т-антигена. Функции, кодируемые первыми 127 остатками (также с N-конца) и «средними» 106—114 остатками (сходен с соответствующим участком в Е1А аденовирусов) и между точками 127—250, включают в себя способность связываться с продуктом гена РЫ восприимчивости к ретинобластоме (но без сайта связывания с р53) и трансактивностью гетерологичных промоторов Оказалось, что свойство к росту, не зависимому от подложки, «разделяется» генетически от туморогенности {Cook D. N., Hassell J. А., 1990; Dyson N. et al., 1990; Thompson D. L. et al., 1990; Trifillis P. et al., 1990; Sompayrac L., Danna K. J., 1991].
Анализ в течение как минимум 20-клеточных делений многих линий показал, что экспрессия большого Т-антигсна SV40 достаточна для индукции хромосомных аберраций и изменения плоидности |Stewart N., Bacchetti S., 1991 ]. Следовательно, данный белок дестабилизирует клеточный геном, причем возникающие в этот момент специфические мутации могут приводить к иммортализации клеток
Средний Т-антиген вируса PY иммортализирует клетки с низкой эффективностью. Это свидетельствует о том, что ген pmt обладает как иммортали- зирующими, так и трансформирующими свойствами в зависимости от системы детекции. Им моргал и за ция клеток большими Т-антигенами PY и SV40 включает в себя рецессивную модификацию клеточною генома [Pereira Smith О. М., Smith J. R., 1987; Srinivasan A. ct al., 1989].
Обнаружено, что туморогенность среднего Т-антигена вируса PY обусловливается наличием аланина-373, поскольку замена его на валин лишает трансформированные клетки способности индуцировать опухоли у животных |GeLinas С. et al., 1989]. Аналогичный эффект оказывала также замена фенилаланина на тирозин в положении 315 [Talmage D. A. ct al., 1989]. Причем это замещение удаляет основной сайт фосфорилирования иод действием ррбО ,ге и, как было показано, является критическим этапом для связывания среднего Т-антигена PY с фосфатидилинозитол-3-киназой и в последующем для полной экспрессии трансформирующего потенциала вируса полиомы
В молекуле Т-антигена SV4O обнаружена консервативная аминокислотная последовательность — гомолог второму домену в белках, кодируемых EIA-областью аденовирусов человека типов 2; 4; 5; 7 и 12 и аденовируса обезьян SA7 (Moran Е., 1988]. Оказалось, что аналогичная структура находится и в Т-антигене вируса полиомы. Получен химерный белок Е1 А, в котором собственный домен (с координатами 121—139 аминокислотных остатков) был замещен участком Т-антигена SV40 с координатами 101—119 остатков Показано, что этот химерный белок обладает той же трансформирующей активностью, что и природный белок Е1А аденовирусов. Химерный белок осаждался из гомогената трансформированных клеток в комплексе с теми же клеточными полипептидами, что и нормальный белок Е1А.
В трансформированных клетках грызунов ДНК полиомавирусов интегрирует с хромосомной ДНК в неспсцифических участках по механизму запрещенной рекомбинации. Фланкирующие участки клеточной ДНК не содержат онкогенов и подвергаются множественным перестройкам. Для неопластической трансформации необходима экспрессия ієна pmt вируса PY. Показано, что некоторые линии клеток, трансформированные вирусом PY, претерпевают спонтанную реверсию к нормальному фенотипу, обусловливаемую нарушениями экспрессии гена pmt (Fried М. et al., 1986]. Такие реверсии иногда происходят вследствие одной точечной мутации в участке перекрывания кодирующих зон средней) и большого Т-антигенов.
Использование различных сконструированных плазмид, содержащих отдельные фраімснтьі генов ранней области полиомавирусов, позволило установить, что фрагмент большою Т-антигена SV40 с молекулярной массой 17 000 (121 аминокислотный остаток), расположенный с NHj-конца полипептида, достаточен для превращения клеток в бессмертную линию (иммортализация) и приобретения ими статуса контактной независимости. Мутации, затрагивающие СООН-консц молекулы Т-антигена, не влияют на им- мортализирующую активность вируса (Colby W., Shenk Т., 1982; Petite С. А. et al., 1983; Cole С. N. et al., 1986; Srinivasan A. et al., 1989]. В то же время фрагмент раннего участка генома SV40, расположенный между сайтами рес- триктаз Tag и BamHl и соответствующий экзону 2 большого Т-антигена (0,566—0,144 ед. карты) обладает способностью к полной трансформации клеток крыс линии REF52, а также клеточной линии СЗН10Т1/2. Вместе с тем считают, что экспрессия большого Т-антигена SV40 не индуцирует туморогенность клеток, иммортализированных этим белком (Graessmann A., Graessmann М., 1985; Jat Р. S. et al., 1986].
Анализ различных фрагментов среднего Т-антигена вируса PY показал, что для проявления протеинкиназной активности и способности трансформировать клетки необходимы как С-, так и N-концсвые аминокислотные последовательности в молекуле этого белка. Рост клеток при низких концен-
грациях сыворотки контролируется большим Т-антигсном [Treisman R. et al., 1981; Asselin C. et al., 1983; Rassonlzadegan I. ct al., 1983; Templeton D., Eckhart W., 1984]. Дія оптимальной экспрессии опухолевого фенотипа in vivo необходимо функционирование среднего и малого Т-антигенов вируса PY [Asselin С. et al., 1984].
Таким образом, экспрессии большого или среднего Т-антиісна полиомавирусов достаточно для развития и поддержания трансформированного фенотипа. Малый t-антиген SV40 и PY может либо усиливать трансформацию, либо вызывать различные изменения трансформированного фенотипа. Определен уникальный сегмент гена t-антиген (27 аминокислотных остатков с 3'- конца), кодирующий часть молекулы этого белка, которая существенна для поддержания трансформированного фенотипа [Bikel I. et al., 1986]. Показано, что t-антиген участвует в разрушении сети актиновых фибрилл и индукции синтеза активатора плазминогена, т. с. в тех процессах, которые приводят к полной или максимальной трансформации [Graessman A. et al., 1980; Торр W. С., Rifkin D. В., 1980; Ito et al., 1986]. Такие клетки не прикрепляются к подложке и продуцируют значительное количество протеаз. Именно перечисленными свойствами обусловливается онкогснность трансформированных клеток и, следовательно, она контролируется t-антигеном. Получены данные, позволяющие предположить, что t-антиген может функционировать как опухолевый промотор, а также трансактивировать промоторы некоторых вирусов [Торр W. С. et al., 1981; Locken М. R. et al., 1989]. Кроме того, он играет важную роль в индукции контактной независимости. Показано, что функции t-антигена и NH2-концевого фрапиента большого Т-антигена вируса PY дополняют разные функции среднего Т-антигена [Asselin G. et al., 1983].
Идентифицированы клеточные белки с молекулярной массой 27 ООО, 29 ООО, 32 ООО, 36 ООО, 51 ООО, 56 ООО, 61 ООО, 63 000 и 85 ООО. Они специфически взаимодействовали с t-антиіеном вируса PY [Murphy С. I. et al., 1988; Pallas D. C. et al., 1988]. Связывание каждого из этих белков с этим антигеном было чувствительно к одной или более мутациям в t-антигене, которые делали данный белок трансформационно дефектным. Наиболее чувствительным индуктором в этом отношении оказался белок с массой 85 ООО.
Мутационный анализ функций t-антиіена при продуктивной инфекции позволил I. Martens и соавт. (1989) установить, что этот белок в 10 раз увеличивает синтез вирусной ДНК, зависимый от большого Т-антигена, и является необходимым для образования инфекционных вирусных частиц. В непермиссивной же системе t-антиген необходим для морфологической трансформации [Rode A. et al., 1989].
Следует отметить еще одну функцию большого Т-антигена полиомавирусов — его способность реактивировать нетранскрибирующиеся («молчащие») рибосомные РНК-гены [Bascrga R. et al., 1980; Soprano К. et al., 1980]. Эти антигены, как уже отмечалось, обладают протеинкиназной и АТФазной активностью. Однако основной вопрос остается до сих пор неразрешенным, как связать ферментативные функции с функциональной активностью Т-антигенов. Установлено, что трансформирующая активность среднего Т-антигена вируса PY связана с его способностью взаимодействовать с клеточной тирозинпротеинкиназой рр60с'*ге, т. е. с продуктом клеточного онкогена [Courtneidge S., 1985; Cheng S. Н. et al., 1986; Rassonlzadegan I. et al., 1990]. Взаимодействие между указанными белками, интенсивно активирующее тирозинспсцифичсскую протеинкиназную активность pp60f’wc, зави-
сит от наличия p-изгиба в участке между аминокислотными остатками 177—180 молекулы Т-антигена вируса PY. Показана также абсолютная зависимость трансформирующей активности этою белка от его способности связываться с рр6(Хке. Для образования стабильного комплекса со средним Т- антигеном необходим участок между аснараіином-518 и пролином-525 (Cheng S. Н. et al., 1988]. Полагают, что средний Т-антиген вируса PY может повышать киназную активность белка рр6(ХЛГС путем защиты от фосфорилирования. Установлено, что тирозин-527 является главным элементом С-конца, регулирующим функционирование pp60w in vivo (Cheng S. H. et al., 1988].
Показано, что участки фосфорилирования in vivo рр6(Г "c, связанного co средним Т-антигеном вируса PY в трансформированных клетках, идентичны таковым в онкобелке рр60'"’ге, синтезированною геном sre вируса саркомы Рауса. Полагают, что это связано с увеличением протеинкиназной активности ррбО*'** и трансформацией клеток вирусом PY (Cartwright С. A. et al., 1986]. С помощью нескольких рекомбинантных плазмид установлено, что уровни рр60сис влияют на характер роста и трансформацию клеток грызунов вирусом полиомы (Amini S. ct al., 1986; Schreicr A. A., Gruber J., 1990].
Обнаружено, что 15 аминокислотных остатков с С-конца и N-концсвая часть молекулы среднею Т-антигена вируса PY необходимы для взаимодействия с рр6(Х,ге и последующей активации тирозинкиназы (Cook D. N., Hassell J. А., 1990]. Анализ мутантов, имеющих делению в N-концсвой части указанною антигена, позволил выявить, что первые 6 аминокислотных остатков молекулы этого белка необходимы для активации киназной активно^!! ррбО1”1 и трансформации клеток Rati.-В последующем оказалось, ч;го средний Т-антиген вируса PY способен связываться с несколькими клеточными тирозинкиназами, в том числе с рр6(Х ,гс (Cheng S. Н. et al., 1990; Wyss A. et al., 1990]. Формирование таких комплексов приводит к активации киназы и необходимо для трансформации. Существенно, что в каждом из комплексов присутствует только один тип тирозинкиназы и содержится только одна молекула среднею Т-антигсна вируса PY. Это позволяет предположить, что трансформация под действием вируса PY вызывает одновременную дереіуля- цию нескольких различных путей, контролирующих клеточную пролиферацию.
Очищенный с помощью аффинной хроматографии средний Т-антиген вируса PY в комплексе с рр6(Х,гс проявляет минимальную фосфатидилинози- толкиназную активность. Оказалось, что в этом комплексе присутствует гре- тий компонент — белок с молекулярной массой 81 (XX) (рр81). Показано, что рр81 фосфорил ирован исключительно по остаткам тирозина и в фосфорил и- рованной форме связан со средним Т-антигеном и рр6(Х ‘гс только в клетках, содержащих трансформирующие мутанты Т-антигсна, и не связан со всеми ^трансформирующими мутантами (Courtneidge S. A., Heber А., 1987]. Фосфатидилинозитол киназная активность комплексов мутантною Т-антигена проявлялась в присутствии рр81 (рр85). Исходя из этого, авторы предполагают, что рр81 представляет собой фосфатдил инозитол киназу. Методом изо- элсктричсского фокусирования выявлены К) различных форм рр85, которые могут быть разделены на два семейства: рр85 и рр86 (Cohen В. et al., 1990]. Отношения между этими семействами моїуг варьировать в различных клетках, причем отдельные виды внутри каждого семейства могут различаться по уровню фосфорил ирован ия. Сходные формы рр85 выявлялись в ассоциации с
рр60с'ив. Осечено возрастание фосфорилирования ио тирозину в процессе трансформации под действием среднею Т-антигена PY или ррбО0 ,ге.
Итак, средний Т-антиген вируса PY формирует главным образом комплексы с двумя клеточными ферментами: различными тирозинкиназами, включая и рр6Ос,гс, и фосфатидилинозитол-3-киназой. Получены данные, свидетельствующие о том, что возрастание уровня фосфатидилинозитол-3-киназы обусловлено активацией фосфолипазы С, а также ассоциировано с активацией pp60c*w [Gorg F. R. et al., 1990J. Таким образом, фосфатидилинозитол-3- киназа в клетках, трансформированных вирусом полиомы, связана с комплексом среднего Т-антигена PY и рр60с,гс. При этом продуцируются следующие полифосфоинозитиды: фосфатидилинозитол-3-фосфат и фосфатидилинозитол-3,4-бифосфат [Serunian L. A. et al., 1990].
Протеинкиназная активность связана с Т-антигеном из трансформирующего варианта вируса PY и отсутствует у Т-антигсна из нетрансформирующих hr-t-мутантов PY [Koch W. et al., 1986].
Помимо активации протеинкиназы, белка рр60с ,ге, средний Т-антиген вируса PY способен комплексироваться и активировать киназы рр62суе’ — продукт протонкогена yes и pp59c f,n — продукт онкогена c-fyn, принадлежащего к группе онкогенов, прототипом которых является c-src [Cheng S. Н. et al., 1988; Kypta R. M. et al., 1988; Kombluth S. et al., 1990]. Все указанные онкогены относятся к семейству тирозиновых протсинкиназ, что даст основание считать дерегуляцию этих src-тирозиновых протеинкиназ центральным событием в механизме трансформации клеток под действием среднего Т- антигена вируса PY. Усиление киназной активности у эффекторов приводит і: фосфорилированию (модификации) клеточных факторов, уменьшая или увеличивая их активность, что в конечном счете формирует трансформированный фенотип. При этом, вероятно, существенная роль принадлежит и другим клеточным белкам, в частности белку 85 с массой 85 000 и фосфати- дилинозитолкиназной активностью. С ними также взаимодействуют средний Т-антиген вируса PY [Kaplan D. R. et al., 1988]. Вместе с тем на серии мутантов среднего Т-антигена вируса полиомы В. J. Oruker и соавт. (1990) показали, что ни тирозинкиназная, ни фосфатидилинозитол-3-киназная активность по отдельности или в комбинации нс являются достаточным условием для опухолевой трансформации клеток.
Предполагают, что образование комплекса р53 — большой Т-антиген S V40 является первой фазой трансформации клеток (иммортализация) под действием этого вируса. Доказано, что вновь синтезируемые в цитоплазме большой Т-антиген SV40 и р53 независимо друг от друга мигрируют в ядро. При этом р53 мигрирует туда с несколько большей скоростью, чем Т-антиген, и уже в ядре формирует стабильный комплекс со зрелой формой Т-антигена SV40 и с супер-Т-антигеном SV40 [Me Cormick F., Harlow Е., 1980; Clayton С. et al., 1982; Schmieg F. I., Simmons D. T., 1984; Schreier A. A., Gruber J., 1990]. Образование комплекса происходит достаточно быстро (в пределах 5—30 мин) и зависит от соотношения Т-антигена SV40 и р53. В этом комплексе обнаружено только два белка — большой Т-антиген и р53, причем оба белка соединены нсковалентными связями; р53-связывающий участок локализуется в области аминокислотных остатков 272—517 молекулы Т- антигена SV4O |Schmieg F. I., Simmons D. Т., 1988].
В трансформированных клетках комплекс локализован в ядре и на клеточной поверхности. Т-антиген в составе комплекса фосфорилируется с боль-
шей скоростью, чем в свободной форме. Определен минимальный фрагмент большого Т-антигена SV40, который необходим для связывания с р53. Им оказался полипептид с молекулярной массой 40 ООО; его синтез начинается в точке 0,40 ед. генетической карты ДНК SV40. Белок р53 образует комплекс с Т-антигсном, коэффициент седиментации которого равен 23—25S, в то время как интактный Т-антиген обнаруживается в зоне 14—16S. Комплекс р53—Т-антиген обладал различной стабильностью в исследованных клеточных линиях. Кроме того, каждая линия характеризовалась разным соотношением р53 и Т-антигена в свободном состоянии и в виде комплекса [Fanning Е. et al., 1981].
Сначала комплекс р53—Т-антиген был выявлен в трансформированных SV40 и непермиссивных клетках, зараженных этим вирусом. Причем р53 осаждался сывороткой как против большою, так и малого Т-антигенов ]Run- dell К., Yang Y. С., 1981]. При продуктивной инфекции (в клетках почек обезьян) этот комплекс с помощью иммунопреципитации обнаружить не удалось до тех пор, пока не были использованы сыворотки, содержащие высокий титр антител против большого Т-антигена, а также МАТ против р53. Так, было показано, что комплекс р53—Т-антиген образуется и в литически инфицированных клетках обезьян, но при этом в комплекс включается лишь незначительная часть Т-антигена. Такой комплекс осаждается в градисіггс плотности сахарозы в зоне 20S. Комплекс 20S осаждается как антителами против большого Т-антигена, так и МАТ против р53. Инфекция кісток почек обезьян сопровождается 5-кратным увеличением скорости синтеза р53 по сравнению с таковой в незараженных. клетках, а степень фосфорилирования р53 возрастает в 30 раз [Harlow Е. et al., 1981].
В трансформированных SV40 клетках, содержащих Т-антиген, экспрессия р53 возрастает в 10—20 раз. В Т-антигенотрицательных (Т) рсвертант- ных опухолевых линиях и клонах клеток, полученных путем иммунологической селекции in vivo, содержались небольшие количества р53, как и в исходных родительских клонах. Во всех Т'-клонах, включая и высокоонкогенные, происходило быстрое разрушение р53 — период полураспада составлял 15—60 мин. Напротив, во всех Т*-клонах р53 оказался стабильным (период полураспада 10 ч). Корреляция между количеством р53 и туморогенностью трансформированных клеток отсутствовала [Mora Р. Т. et al., 1982].
В опытах по фосфорилированию р53 трансформированных SV40 кіеток было показано, что этот белок обладает протеинкиназной активностью, которая, однако, незначительно снижалась при добавлении МАТ против этого белка [Jay G., Khoury G., 1980; Roy F. V. et al., 1984]. Комплекс T- антигена — p53 связывается с хроматином трансформированных кіеток, причем с увеличением уровня фосфорилирования Т-антигена повышается аффинность к хроматину [Greenspan D. S., Carroll R. В., 1981]. Обнаружено, что оба белка связаны с пери- и внугрихроматиновыми фибриллами рибонукле- оиротеидов (РНП), содержащими вновь синтезированную hn-PHK [Puvion Е. et al., 1988]. Блокирование репликации вирусной ДНК приводило к диссоциации комплекса Т-антигена с клеточным хроматином. Связь с hn-РНП в фибриллах сохранялась. Предполагают, что связь комплекса с клеточным хроматином играет определенную роль в процессах инициации репликации, регуляции транскрипции, а также индукции и поддержания трансформации. Причем от различий в субъядерном распределении могут зависеть трансформирующие и литические свойства Т-антигсна. Вместе с тем отмечено, что €*
свободный Т-антиген лучше связывается с ДНК. Этим он отличается от комплекса Т-антиген — р53, связывание которого с ДНК менее выражено (Sturz- becher Н ctal., 1983).
Показано, что комплекс Т-антиген — р53 из клеток почек обезьян моделирует биохимическую активность большого Т-антигена SV40 (Tack L. С. et al., 1989). АТФазная активность для комплекса оказалась в 18 раз выше, комплекс был также более активным в гидролизе дГТФ, дАТФ и УТФ.
J. R. Jenkins и соавт. (1988) представили данные, согласно которым Т- антиген в составе комплекса может блокировать (закрывать) последовательность в р53, участвующую в выполнении нормальных функций этого белка. Обнаружено также, что трансформация не зависит от активации р53 в онкогенную форму и при трансформации антипролиферативная способность р53 (белка дикого типа) блокируется Т-антигеном SV401 Jia Y. L., Simmons D. Т., 1990). Предполагают, что большой Т-антиген SV40 индуцирует или активирует протеинкиназу, одним из субстратов для которой служит р53 (Schei- dmann К. Н., Haber А., 1990). Определен сиквенс клеточного белка, специфически связывающегося с одним из участков раннего промотора SV40 и стимулирующего транскрипцию in vitro |Gaillard С., Strauss F., 1990). Согласно данным J. J. Manfredi и С. Prives (1990), связывание и образование гибридов белков р53 и plO5Rb с Т-антигенами полиомавирусов (PY и SV40) необходимо, но недостаточно для проявления онкогенного потенциала этих вирусов.
Наконец, установлено, что малый и средний Т-антигены вируса полиомы и малый t-антиген SV40 образуют стабильные комплексы с белковой фосфа- '-юй 2А (клеточный белок РР2А, ММ 36 000). Эти комплексы, очевидно, иірают важную роль в опухолевой трансформации |Pallas D ct al., 1990).