<<
>>

1.2.3. ИММОРТАЛИЗИРУЮЩИЕ И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ДНК-СОДЕРЖЛЩИХ ОПУХОЛЕРОДНЫХ ВИРУСОВ ГРУППЫ полиомы

Прежде чем перейти к характеристике онкогенов указанной іруппьі виру­сов, целесообразно для понимания механизмов онкогенеза остановиться на общих положениях вирус ною канцерогенеза

В настоящее время известно более 160 опухолеродных вирусов, которые подразделяются на две большие группы: ДНК- и РНК-содержащие.

Основ­ным общим их свойством является способность трансформировать нормаль­ные клсіки в опухолевые in vitro и иногда вызывать образование злокачес­твенных новообразований у животных in vivo. РНК-содсржащие онковирусы (подсемейства онкорнавирусов семейства ретровирусов — онкогенные рет­ровирусы) представляют собой более многочисленную уникальную іруїіпу и являются возбудителями злокачественных новообразований у естественных хозяев, тогда как среди ДНК-содержащих опухолеродных вирусов (семейства папова-, адено- и герпесвирусов, оспенных вирусов и гепадновирусов) только две группы (вирусы папиллом и семейства герпесвирусов) обладают этим свойством, несмотря на исключительно широкое распространение в приро­дных условиях (практически все взрослые животные сероположительны) [Аге­енко А. И., 1969, 1974, 1975, 1978, 1986; Зильбер Л. А. и др., 1975; Струк В. И., 1982; Быковский А. Ф. и др., 1983; Gross L., 1970; Temin Н. М., 1988; Dalgleish A. G. 1991].

Основной (а иногда, может быть, единственный) путь передачи ДНК- содержащих опухолеродных вирусов — горизонтальная инфекция, причем она может иметь место в самые первые дни после рождения. Общим биологи­ческим свойством ДНК-содержащих опухолеродных вирусов является их спо­собность вызывать как острый цитоцидный (клетки природного хозяина — пермиссивные клетки, позволяющие вирусу осуществить полный репродуктивный цикл), так и абортивный (нспермиссивные или полупермис- сивные клетки) тип инфекции, иногда приводящий к неопластической тран­

сформации пораженных клеток. Следовательно, чтобы трансформировать клетку природного хозяина, необходим либо дефектный, либо инактивиро­ванный вирус, но, естественно, содержащий трансформирующие области (онкогены).

Иными словами, необходимо прерывание продуктивной инфек­ции, обычно происходящее на поздних стадиях вирусной репродукции (все поздние стадии, в том числе и репликация ДНК) в нспсрмиссивных клетках, а в полупермиссивных клетках — на стадии сборки вирусных частиц.

Центральный постулат вирусогенстической теории происхождения опу­холей, сформулированной Л. А. Зильбером в начале 60-х годов о необходи­мости интеграции вирусного генома с клеточным для стабильной опухолевой трансформации, на сегодняшний день подвергся частичной ревизии. Оказа­лось, что в некоторых случаях само присутствие частично или полностью активного вирусного генома в пермиссивных и непсрмиссивньгх клетках в форме эписом, т. е. не связанного с хромосомной ДНК (экстрахромосомно) или связанного с ядерной ДНК лабильными водородными связями, может обеспечивать проявление определенных свойств неонластически трансфор­мированных клеток или полностью стабильно поддерживать опухолевый фе­нотип. Такое вирус-клеточное взаимодействие преимущественно свойствен­но папиллома- и герпесвирусам. Интеграция, обусловливающая стабильную трансформацию, характерна, как правило, для полиома-, адено- и ретровиру­сов. Вместе с тем описана также способность некоторых паповавирусов пер­систировать в свободном неинтеїрированном состоянии, когда функциони­рование их генов находится под неизвестным клеточным контролем, препят­ствующим синтезу инфекционного вируса. Поданным рестрикционною ана­лиза, неинтегрированные вирусные последовательности представляют собой кольцевые, ковалентно замкнутые ДНК длиной в целый геном, например ДНК SV40. Не обнаружено разницы в структурах эписомной вирусной ДНК в клетках, трансформированных SV40 дикою типа и мутантом А1499 JRama- gopal S., 1983J.

Внедрение новой, вирусной ДНК (или ДНК-провируса ретровирусов), содержащей различные регуляторные последовательности, и ее взаимодейст­вие с геном клетки не всегда остаются «бесследными» для клетки Важно замегить, что способность опухолеродных вирусов вызывать фенотипические и генетические изменения прежде всею связана со свойством их геномов интегрировать с генетическим аппаратом клетки.

Установлено, что интегра­ция происходит не только при трансформации, но и при продуктивной ин­фекции опухолеродными вирусами (когда воспроизводится новое вирусное потомство) и, вероятно, является их характерным признаком, а в случае ретровирусов — одним из этапов их вегетативного репродуктивною цикла. Причем для онкогенеза наибольшее значение имеют прежде всего уник к ь- ные стадии — синтез ДНК на матрице РНК и интеграция вновь синтезиро­ванного ДНК-провируса в клеточный юном. В процессе жизненного цикла ретровирусов, как установлено, в зараженной ими клетке образуется три типа молекул провирусной ДНК: линейная и две кольцевые, различающиеся меж­ду собой количеством длинных концевых повторов (ДКП). Причем один тип кольцевых молекул содержит два спаренных ДКП — так называемай папин- дромная последовательность (Lobel L. I. et al., 1989J. Пока не ясно, какой из этих трех типов молекул ДНК-провируса отвечает за ею дальнейшую интег­рацию в клеточный геном.

Таким образом, в инфицированных ретровирусами клетках в результате

обратной транскрипции образуются провирусы, представляющие собой но­вые генетические элементы. Эти генетические структуры насыщены сигнала­ми, которые регулируют транскрипцию, трансляцию и сплайсинг. С одной стороны, они могут влиять на экспрессию клеточных генов, а с другой, могут осуществлять синтез новых для клетки вирусных РНК и белков. Большая часть этих сигналов сконцентрирована в LTR (long terminal repeat — large terminal redundacy—длинные прямые концевые повторы) и, следовательно, дублирована. LTR имеют структуру U3-R- U5 и располагаются на концах линейной ДНК, синтезированной ревертазой на матрице вирусной РНК. За­тем образуется циркулярная ДНК с одним и двумя LTR. LTR содержат цис­действующую узнавающую последовательность для фсрмеїгга, осуществляю­щего интеграцию, поскольку интегрируют только циркулярные молекулы. Этот участок обозначен att (attchment). Показано, что кольцевые молекулы с одним LTR являются побочным продуктом и не участвуют в интеграции [Panganiban А.

Т., 1985; Aronoff R., Linial М., 1991].

Интеграция ретровирусной ДНК в геном клетки включает стадию специ­фического расщепления вирусной кольцевой ДНК эндонуклеазой, кодируе­мой геном pol (Endo-pol). В реакции in vitro Endo-pol расщепляет обе цепи репликативной формы ДНК вирусов сарком и лейкозов птиц в области со­членения доменов U3 и U5 LTR. Для специфического расщепления вирусной кольцевой ДНК и интеграции этой ДНК в клеточный геном необходимо не более 22 п. н. домена 5 и не более 8 п. н. домена 3. С помощью серии делеционных мутантов продемонстрировано, что утрата необходимых для расщегиіения последовательностей препятствует размножению вируса |Со- Ьгіпі К. D. et al., 1987]. Показано, что повреждения 3'-концевой области гена рої вируса лейкоза мышей делают вирус дефектным по интеграции. Оказа­лось, что псевдотипы, образованные из белков таких дефектных по интегра­ции ретровирусов и ДНК другого мутанта, дефектного по репликации, все же способны с низкой частотой вызывать трансформацию клеток (Hagino-Yam- agishi К. et al., 1987]. Предполагают, что при этом происходит неспецифичес­кая интеїрация в геном клетки димерных или тримерных форм провирусной ДНК, механизм возникновения которых пока нс ясен.

Итак, получены генетические доказательства того, что ДНК-эндонуклеаз- ный домен белка рої ретровирусов необходим для интеграции их провируса в клеточный геном {Quinn Т. Р., Grandgenett D. Р., 1988].

G. Qualandi и соавт. (1990) представили материалы рестрикционного ана­лиза, подтверждающие гипотезу об интеграции ДНК вируса Эпштейна-Барр (EBV) в геном клеток человека с вовлечением сегмента, от которого зависит репликация этой ДНК. Вероятно, разрушение этого сегмента опР (единствен­ного сегмента, ответственного за воспроизведение эписом EBV) является необходимым условием для сохранения генома EBV, интегрированного в хромосомы человека.

Интеграционный принцип взаимодействия вирусного генома с геномом клетки имеет, по-видимому, большое общсбиологическос значение. Вероят­но, он наряду с мутациями и рекомбинациями является фактором эволюции, обеспечивающим обмен генетической информацией в биосфере как внутри видов, так и между особями, которые принадлежат к разным таксономичес­ким группам среди эу- и прокариот.

Иногда же могут возникать «интегратив­ные» патологические процессы, например аутоиммунные болезни, опухоле­вая трансформация, аномальные типы «обычных» и «медленных» вирусных

инфекций и др. Поэтому изучение закономерностей и механизмов интегра­ции принципиально важно не только для понимания опухолевой трансфор­мации.

Вместе с тем механизм физической интеграции вирусной и клеточной ДНК практически не исследован, особенно плохо изучены последовательные промежуточные этапы этого процесса. Мало известно о вирусных и клеточ­ных факторах, ферментных системах, осуществляющих рекомбинации ви­русного и клеточного геномов. Остается открытым вопрос о специфичности мест интеграции в отношении клеточного генома, хотя продолжают накапли­ваться факты об интеграции некоторых опухолеродных вирусов только в определенное место определенных хромосом. Например, трансферирован- ные в 6 клонов фибробластов человека ДНК рекомбинантного гибридного вируса аденовирус типа 5 — SV40 преимущественно интеїрировали в два участка хромосомы 1, а именно, в короткое плечо субтеломерной области (1р35-р ter) и длинное плечо субтеломерной области (lp42-pter), где при аденовирусной инфекции образуются бреши в районе маркерных генов А12М2 и А12МЗ. Следует обратить внимание на то, что сайт модификации 1 р (А 12М2) в ДН К аденовируса типа 12 служит также сайтом преимущественной интег­рации гибридного вируса в клетках человека. ДНК вируса папилломы чело­века интегрирует в три общих и один вариабельный сайт ДНК клеток Hela [Alhadeff В. et al., 1987]. Поданным гибридизации in situ, интегрированные последовательности ДНК вируса папилломы человека типа 16 располагаются только в хромосомной области 12ql4q-15 у линии клеток из внутриэпители­ального новообразования вульвы |Sastre-Garau X. et al., 1990]. Определены три общих сайта интеграции вируса лейкоза мышей линии Френд при мие- лобластном лейкозе: Fim-1, Fim-2 c-fms и Fim-З, которые картируются на хромосомах 13; 18 и 3 соответственно (Sola В. et al., 1988].

Показано также, что иммортализация клеток происходит только в том случае, когда провирус вируса SFFV интегрирует в специфический сайт в клеточном геноме [Shiro G. et al., 1988]. Однако пока не ясны механизмы преимущественной интегра­ции с определенными клеточными локусами. Установлено, что активация репарационных систем не влияет на множественность интеграции и сущес­твует специфичность интеграции по отношению к вирусному геному.

Следует особо подчеркнуть, что во всех случаях при интеграции опухоле­родных вирусов рамки считывания трансформирующих областей всегда со­храняются, так же как и длинный контрольный район вируса.

Существенно, что в отличие от ДНК-содержащих опухолеродных вирусов клетки, зараженные ретровирусом, как правило, сохраняют жизнеспособ­ность, продолжают размножаться, при этом изменяются генетически и фено­типически, одним из таких изменений является опухолевая трансформация. В зависимости от трансформирующего действия на клетки in vitro и способ­ности вызывать различные типы новообразований in vivo ретровирусы можно разделить на 4 группы.

I. Высокоонкогенныевирусы, обладающие сильным (в основ­ном вирусы сарком: RSV, FSV, PRCII, Mo-MSV, Ha-MSV и др. и за редким исключением вирусы острых лейкозов, например, МС29, СМИ, ОКЮ, МН2) трансформирующим действием на культуру фибробластов и вызывающие почти в 100% случаев у чувствительных животных главным образом саркомы и различные острые лейкозы с коротким латентным периодом (около 2 нед). В природных условиях эти вирусы обычно циркулируют в виде смешанных

популяций. Их основу составляют саркомно-лейкозные комплексы вирусов птиц и мышей (Skalka А. М. et al., 1989]. За исключением вируса саркомы Рауса (RSV) и близкородственных ему вирусов, все известные представители этой группы дефектны по репликации и близки по структуре. Бластомоген- ные потенции их обусловливаются наличием различных трансформирующих областей (генов опс-онкогенов), захваченных ими из генома клетки в процес­се рекомбинации. Следовательно, они имеют клеточное происхождение. Ятя саморепродукции ретровирусов указанные гены не нужны, их последователь­ности не родственны последовательностям структурных вирусных генов (gag, рої и env), но зато близкородственны нуклеотидным последовательностям нормальных клеток. Онкогены ДНК-содержащих опухолсродных вирусов, наоборот, в процессе длительной эволюции стали необходимы для реплика­ции вируса, однако их последовательности негомологичны клеточным после­довательностям, т. е. вероятно, они превратились в вирусные и перестали быть клеточными.

Можно заключить, что вирусные онкогены имеют клеточное происхожде­ние и возникли в результате редких трансдукций вирусами определенных клеточных последовательностей, которые в составе вирусного генома могут экспрессироваться в форме отдельных независимых или слитных белков. L. Н. Wang (1987) утверждает, например, что процесс трансдукции протоон­когена c-src ретровирусами птиц осуществляется в две стадии. На первой провирусная ДНК рекомбинирует с 5-областью протоонкогена. На второй стадии продукт транскрипции такой химерной последовательности рекомби­нирует с РНК трансдуцирующего вируса. Причем второй акт рекомбинации происходит с существенно более высокой частотой, очевидно, из-за наличия увеличенных гомологий.

Идеальной системой для изучения механизма трансдукции протоонкогена считают эритробластоз, индуцированный вирусом лейкоза птиц при итера­ционной активации клеточного гена c-егЬВ fRaines М. A. et al., 1988]. В 25% проанализированных случаев этою лейкоза высвобождались зрелые ретрови­русы, которые с необычно высокой частотой захватывали активированный онкоген егЬВ. Кроме тою, эти лейкозные образцы представляют собой бога­тый источник выделения новых вирусов, трансдуцирующих протоонкоген с- егЬВ. Некоторые провирусы сохраняли в своих геномах участки, соответству­ющие пол и-А в мРНК. Последовательности из 6 остатков аденозина в гене env вируса лейкоза птиц, вероятно, определяют З'-рекомбинацию, необходи­мую для образования этих вирусов. В последющей серии экспериментов были сделаны молекулярные характеристики трех егЬВ-трансдуцирующих вирусов, возникших при эритролейкозе, индуцированном вирусом лейкоза птиц. Оказалось, что протяженная внутренняя деления вблизи киназною домена активирует фибросаркомный и гемангиомогенный потенциал тран­слированного протоонкогена егЬВ.

Итак, ретровирусный онкоген v-erbB является мутантом гена c-егЬВ, кото­рый кодирует на поверхности клеток рецептор эпидермальною фактора ро­ста (РЭФР). Мутации проявляются в трех формах: 1) большая деления, кото­рая приводит к удалению целого лигандсвязывающего домена РЭФР; 2) мень­шие делеции затрагивают карбоксил-терминальный домен РЭФР; 3) точеч­ные мутации вызывают консервативные замены аминокислот. Показано, что при наїичии большой делеции не требуются другие мутации, чтобы фиброб­ласты ірьізунов под действием гена с-еФВ приобретали онкогенный фенотип

(Wells A., Bishop J. M., 1988]. Особенно это касается делений, влияющих на карбоксильный конец продукта гена. Удаление лигандсвязывающею домена из РЭФР достаточно для получения трансформирующего белка. Деления карбоксильного конца РЭФР, по-видимому, играет вторичную роль в тран­сформации, воздействуя на круг хозяев и силу трансформации. Не получено данных о влиянии точечных мутаций на превращение гена с-егЪВ в онкоген. По-видимому, увеличение активности РЭФР способствует онкогенезу.

Молекулярно-биологическими методами установлено, что нормальные клетки позвоночных действительно содержат семейство таких эволюционно консервативных последовательностей (протоонкогенов). Очевидно, они не­посредственно участвуют в дифференцировке клеток или других жизненно важных процессах и моїут вовлекаться в онкогенез, обусловливая, по-види­мому, определенные этапы опухолевой трансформации клеток, однако после соответствующих мутаций.

Показано, что вирусные онкогены и клеточные протоонкогены, имеющие общие специфические последовательности, не изогенны IDucsberg Р. Н., 1983]. Они отличаются друг от друга по рассеянным точечным мутациям, наличию делений и уникальных кодирующих участков, которые отсутствуют у их клеточных гомологов, например протоонкогенов c-src, c-myc, c-ras, c-fps и др. [Lee W. Н. et al., 1983; Wang J., Yin J., 1983; Watson R. et al., 1983; Iba H. et al., 1984; Ricketts M. H. et al., 1988]. Естественно, что продукты вирус­ных и клеточных онкогенов также отличаются друг от друга и, следовательно, функционально моїут быть рахзичны: вирусные онкобелки трансформируют клетки, а продукты протоонкогенов могут выполнять разные нормальные функции как в эмбриогенезе, так и в физиологических процессах в организ­ме [Muller R. et al., 1983; Watson R. et al., 1983]. Отмечено, что некоторые клеточные онкогены экспрессируются на определенных стадиях онтогенеза и при регенерации органов и тканей. Так, при регенерации печени в 2’/2-4 раза увеличивается количество транскриптов c-Ha-ras, c-K-ras и с-тус-специфи- ческих РНК [Goyette М. et al., 1983; 1984; Makino R. et al., 1984]. Причем высокий уровень экспрессии онкогенов в онтогенезе (например, гена c-src), по данным A. Bemekow и М. Gebler (1984), не всегда связан с пролифера­цией, а, возможно, играет определенную роль на ранних стадиях дифферен­цировки мезенхимальных клеток или же осуществляет контроль метаболиз­ма. В частности, J. G. Spivack и соавт. (1984) показали, что он контролирует прогестерониндуцирующее созревание ооцитов. Иными словами, протоонко­гены, содержащие онкородственныс последовательности с вирусными тран­сформирующими генами, экспрессируются в нормальных клетках, как пра­вило, в соответствии с нормальными функциями.

Итак, сравнительные исследования структуры вирусных онкогенов (осо­бенно ретровирусов и протоонкогенов) выявили, что все вирусные трансфор­мирующие области на самом деле в большей степени являются новыми гена­ми, чем трансдуцированными клеточными. Протоонкогены часто экспресси­руются в нормальных клетках. Не выделен ни один из протоонкогенов, кото­рый в активированном состоянии трансформирует диплоидные клетки, не обнаружено также диплоидно-клеточных опухолей с активированными про­тогенами. Более тою, оказалось, что вероятность спонтанной трансформа­ции in vivo по крайней мере в 10’ раз ниже, чем это предсказано на основа­нии гипотезы активации протоонкогенов [Duesberg Р. Н., 1987]. Следова­тельно, есть основания предполагать, что скорее всею только нарушения

целостности генов или рекомбинации, изменяющие конфигурацию генов клетки, могут приводит к образованию вирусных онкогенов и, возможно, клеточных онкогенов. Генетическая нестабильность и в первую очередь кло­нальные аберрации хромосом, обусловливающие ее и постоянно присутству­ющие в опухолевых клетках, являются убедительным подтверждением необ­ходимости генетических перестроек, которые приводят к возникновению неопластически трансформированных клеток. Таким образом, злокачествен­ные новообразования, вероятно, могут возникать вследствие хромосомных аберраций, как это предполагали еще в 1911 г. К. Bauer и в 1914 г. Т. Boveri.

Что касается онкогенов ретровирусов (особенно острых лейкозов и сар­ком), то эта группа сыграла решающую роль в формировании концепции, согласно которой нормальные клетки содержат множество генов, потенци­ально способных становиться онкогенными детерминантами после трансдук- ции в геномы ретровирусов. Среди идентифицированных у вирусов острых лейкозов различных онкогенов, имеющих клеточное происхождение, наибо­лее подробно изучен онкоген myc, который участвует как в вирусиндуциро- ванном, так и невирусном онкогенезе. На моделях рсзровирусных лейкозов птиц впервые детально изучены основные свойства и уникальные варианты структуры и экспрессии онкогенов, в частности выявлена структура гибрид­ных онкогенов, представленных клеточными и вирусными кодирующими последовательностями. Впервые описана сборка двух различных клеточных протоонкогенов в одном ретровирусном геноме пока только у трех вирусов: c-myb и c-ets у вируса лейкоза птиц ES4 и Е26, c-myc и c-mil у вируса МН2 и егЬА и егЬВ у вируса AEV (Graf Т. et al., 1986, 1988; Saule S. et al., 1987; Rupniwska Z., 1989]. Показана кооперация двух онкогенов в трансформации клеток, в частности, вирусом МН2, который быстро трансформирует in vitro гемопоэтические клетки кур. Анализ делеционных мутантов ретровирусов МН2 позволил установить, что эти два онкогена вместе создают систему аутокринного роста, в которой v-myc стимулирует клеточную пролифера­цию, a v-mil индуцирует ФР миеломоноцитов кур (cMGF). В результате ретровирус МН2 эффективно индуцирует моноцитные лейкозы и опухоли почек, а делеционные мутанты МН2, лишенные как функциональной) гена v- mil, так и v-myc, не вызывают эти бластом атозные процессы.

Получены мутанты ретровируса МН2, содержащие по одному из этих онкогенов. На клетки нейроретины мутанты только с v-mil (продукт Р110*“*' ~*) оказывают митогенное действие, которое нехарактерно для мутантов только с myc (продукт Р61/63гаус). Существенно, что последние мутанты обладаю! способностью трансформировать фибробласты, чего не могут мутанты только с mil (Saule S. et al., 1987].

На системе клеток костного мозга показано, что онкоген егЬА ретровиру­са AEV, продукт которого гомологичен рецептору тиреоидного и стероидно­го гормонов, ответствен за блок в дифференцировке этих клеток, а егЬВ (его продукт гомологичен редуцированному рецептору ФР эпидермиса) — за не­контролируемую пролиферацию. Установлено, что егЬА-специфический бе­лок содержится как в ядерной, так и цитоплазматической фракциях, причем обе формы способны связываться с ДНК и, очевидно, могут выполнять фун­кции транскрипционных активаторов (Boucher Р. et al., 1988; Geary В. В., Privalsky М. L. 1990]. Способность этого белка связываться со специфичес­кими сайтами на хроматине, что модифицирует экспрессию соседних генов, очевидно, является узловым моментом в механизме неопластической тран-

сформации. Продукт двух генов myb и ets ретровируса Е26 P135wmyb_eu вызы­вает смешанный эритроидно-миелоидный лейкоз у цыплят и трансформирует in vitro миелоидные и эритроидные клетки [Saule S. et al., 1987J. Предполага­ют, что myb-детерминанты осуществляют связь с ДНК и участвуют в тран­сформации миелобластов, а ets-детерминанты участвуют в трансформации эритроидных клеток и фибробластов. Обнаружено, что трансактивация необ­ходима для трансформации клеток геном v-myb [Lane Т. et al., 1990].

Большой успех был достигнут в изучении функции клеточных аллелей онкогенов вследствие открытия высокой гомологии последовательностей между онкогенами вирусов лейкоза птиц и генами человека, кодирующими рецепторы ФР.

II. Вирусы острых лейкозов не содержат в составе своего генома клеточных онкогенов и таким образом отличаются от высокоонкоген­ных вирусов лишь механизмом трансформирующего действия, поскольку они могут in vitro трансформироватъ клетки разных типов, а у чувствительных животных они вызывают различные острые лейкозы со средним латентным периодом от 2 нед до нескольких месяцев. Вирусы этой группы могут быть как дефектными по репликации, так и недефектными; характеризуются сред­ними и сильными бластомогенными потенциями. К последним, например, можно отнести дефектный по репликации и индуцирующий фокусы в селе­зенке вирус SFFV, возникший в результате делеции в основном гене env (область р15), который кодирует gp50—55. Этот гликопротсид, вероятно, является производным gp70, поскольку преципитирустся антисывороткой против gp70 MuLV [Frisby D. P. et al., 1-980; Mol J. N. et al., 1982; Clark S. P., Mak T. W., 1983; Adachi A. et al., 1984; Gonda M A. et al., 1984]. Вирус SFFV индуцирует фокусы пролиферирующих эритроидных клеток-предшествен­ников в селезенке взрослых мышей и быстро вызывает эритробластоз у ново­рожденных и взрослых особей. Показано, что онкогенный потенциал SFFV обусловлен измененным продуктом гена env — белком gp50— 55, характери­зующегося нарушенным процессингом и неспособностью к упаковке в вири- оны. Кроме того, различия в белковых продуктах генов env SFFV и других ретровирусов объясняют измененным характером гликозилирования gp50— 55 [Wolff L. et al., 1983]. Методами генетической инженерии установлено так­же, что измененный мембранный домен этого белка или утрата цитоплазма­тического домена в gp50— 55 (либо оба эти фактора) необходимы для индук­ции эритролейкоза под действием SFFV, однако они не связаны с нарушени­ем способности gp50— 55 транс портироваться на клеточную поверхность [Srinivas R. V. et al., 1987; Watanabe N. ct al., 1990]. Индукция эритролейкоза, как выяснилось, зависит и от присутствия участка из b'3Fr-MuLV (Sitbon М. et al., 1990].

L. Wolff и S. Kuscetti (1988) после котрансфекции мышиных фиброблас­тов рекомбинантной плазмидой с геном env и ДНК вируса-помощника уда­лось получить сток вируса SFFV, из всех вирусных белков экспрессирующего исключительно gp52. Такой вирус меньше чем через месяц после заражения вызывал эритролейкозы у 80— 100% животных и обладал способностью тран­сформировать эритробласты в культуре. Таким образом, ген env SFFV, дей­ствительно, является онкогеном вирусной природы.

В то же время ген env вирусов группы MCF (mine cells focus forming — образующие очаги трансформации в культурах клеток легкого норки) кодирует gp70, который трансформирует предшественников лимфо-

идных клеток. Оба трансформирующих белка содержат типоспецифические антигенные детерминанты, характерные как для основного гликопротеида оболочки экотропных вирусов MuLV-E, так и для аналогичного белка ксе- нотропного MuLV-X [Frisby D. Р. et al., 1980; Vogt P. K., 1982]. Следователь­но, оба эти гликопротеида кодируются гомологичными генами и, несмотря на различия в молекулярной массе (gp50— 55 SFFV и gp70 MCF-MuLV), имеют сходную структуру. Белок gp50— 55 локализуется в основном в эндоплазма­тическом ретикулуме, ядерной фракции и частично на клеточной поверхнос­ти (gp70 также находится на поверхности клеток) и входит в состав вирио- нов. Продемонстрировано превращение вируса эритролейкоза Френд (С. Friend), вызывающего фокусы в клетках легкого норок, в вирус, индуцирую­щий фокусы в селезенке путем модификации 3' -половины гена env [Watan­abe N. et al., 1991 ]. Возможно, лейкозогенное действие этих вирусов обуслов­лено изменением клеточной поверхности и в связи с этим модификацией пролиферативных потенций трансформированных клеток.

Показано, что gp50—55 необходим для инициации пролиферативной фазы эритробластов при эритролейкозе Френд и изменения в мембранах, вызываемые этим белком, могут быть скорее первичными причинами тран­сформации, а не только вторичным следствием развития бластоматозного процесса [Ruta М. et al., 1983]. В последующем оказалось, что данный вирус­ный белок путем непосредственною связывания с рецептором эритропоэтина (Еро-Р) в эндоплазматическом ретикулуме может стимулировать ею метабо­лизм и в отсутствии нормальных условий для функционирования этою ре­цептора способен вызывать пролонгированную пролиферацию инфициро­ванных эритроидных клеток [Li J. Р. et al., 1990; Yoshimura A. et al., 1990]. Считают, что указанный процесс является первым этапом в индукции лейко- могенеза вирусом Френд. В то же время R. Paul и соавт. (1991) обнаружили в эритролейкозных клетках, зараженных этим вирусом, общий сайт интегра­ции провируса, обозначенный Spfi-1. С помощью генетических методов он обнаружен на хромосоме 2 мышей. Данные сиквснса свидетельствуют, что Spfi-1 кодирует белок, идентичный Pul, транскрипционному фактору, кото­рый родствен онкогенам семейства ets. Эти факты позволяют предполагать, что Pul блокирует дифференцировку эритробластов и вызывает иммортали­зацию клеток. Установлено также, что предрасположенность к эритролейко- зу контролируется клеточными генами U, S1 и Fv-2, а развитие процесса коррелирует с инактивацией гена-супрессора р53 и активацией генов семей­ства ets (Spl-l, Pul и Fll-1) [Ben-David Y., Bernstein A., 1991].

В группу II отнесены также лимфотропные вирусы человека: HTLV-I (вызывает кожный Т-клеточный лейкоз/лимфому взрослых) и HTLV-II, ассо­циированный с Т-клеточными лейкозами, хотя окончательно спектр заболе­ваний не установлен. Кроме генов gag, рої и env, типичных для всею семей­ства ретровирусов, эти вирусы содержат юн x-lor(px) (локализован между геном env и З’-LTR). Вирус иммунодефицита человека HTLV-III (HIV), также относящийся к лимфотропным вирусам, имеет 6 дополнительных генов: 1) tat кодирует белок, контролирующий экспрессию вирусных мРНК; этот белок способствует увеличению концентрации РНК-полимеразы в районе промото ра, усиливая таким образом инициацию транскрипции, и, кроме того, спо­собствует элонгации транскриптов; белок необходим также для экспрессии ієна env и переноса мРНК env в ядре; 2) rev контролирует функции различ­ных мРНК, осуществляющих транспорт структурных протеинов вируса в

цитоплазму; 3) регуляторный ген ncf уменьшает экспрессию всех мРНК, иірая большую роль в латентной фазе развития вируса; 4) вирусный белок R гена vpr необходим для репликации и проявления цитопатогсн пости в лим­фоидных клетках; 5) vif-регуляторный ген с малоизвестной функцией; 6) vpu (HIV-1) и vpx (HIV-2) и все вирусы иммунодефицита обезьян (SIV) увеличи­вают трансмиссионный потенциал вирусов и стимулируют продукцию анти­тел у больных, могут быть использованы в диагностике. К настоящему време­ни четко определены два типа вирусов иммунодефицита человека, различаю­щиеся по поверхностным гликоиротеидам: gpl 10—120 и gp41 (HIV-1) и gpl 25— 130 и gp36 (HIV-2).

На поверхности HIV имеется значительное число дискретных участков, представляющих собой мишени для иммунной атаки нейтрализующими ан­тителами, антителами, опосредующими антителозависимую клеточную цито­токсичность, и цитотоксическими Т-лимфоцитами (Bologncst D. Р., 1990]. Значительный интерес представляет факт наличия в некоторых областях оболочки HIV доминантных иммуногенных эпитопов. С участками оболочки HIV связывается способность вируса к проявлению инфекционное™. Анализ тонкой структуры гипервариабельных участков свидетельствует, что не все из них вариабельны и в некоторых местах они строго консервативны. Естес­твенно, выяснение структурно-функциональных взаимоотношений вариабель­ных и консервативных участков поможет раскрытию механизма связывания HIV с клеткой-мишенью. Показано, что тропизм к определенному хозяину и цитопатогенное действие (ЦПД) обусловливает ген оболочки. Например, об­наружено, что фрапиент EcoRl/Sspl, содержащий 455 аминокислотных ос­татков N-конца молекулы gpl20, очевидно, контролирует инфекцию переви­ваемых линий Т-клеток (Shioda Т. et al., 1990]. В то же время, учитывая антигенное сходство gpl20 с некогорыми лимфоцитарными структурами (в том числе с рядом антигенов МНС класса II), предполагают, что этот белок может выступать в качестве провоцирующего агента для запуска антихелпер- ного аутоиммунною процесса (Ezzell С., 1991]. С этой позиции объясняют также фатальную депрессию иммунных функций, которая имеет место при вирусном поражении значительной доли популяции Т-хелперов.

Экспрессия с HIV/LTR регулируется клеточными факторами в ответ на активацию Т-лимфоцитов, действие цитокинов и дифференцировку макро­фагов, т. е. процессов, играющих критическую роль в прогрессе заболевания (Collins М. et al., 1990]. Определен набор белков, способных взаимодейство­вать с HIV. Один из них NF-kB, связываясь с энхансером LTR, увеличивает вирусную транскрипцию в огвет на различные стимулы. Идентифицирован участок (I—278) LTR, выполняющий функцию негативною регуляторною элемента, удаление которою повышает экспрессию с LTR в клетках Jurkatt. Следовательно, этот участок играет важную роль в поддержании латентною состояния HIV. Внутри данною участка выявлено два основных сайта связы­вания, с каждым из которых связываются новые белки из Т-лимфоцитов.

Принципиальное отличие HIV от HTLV-I и II состоит в том, что послед­ние вирусы трансформируют Т4-лимфоциты, a HIV их лизирует (Yoshida М., 1983; Yamamoto N., Ninuma Y., 1985; Gallo R. C. et al., 1987; Mann D. L. et al., 1987; Dedcra D. et al., 1989; Montagnier L., 1989; Yip M. T., Chen I. S., 1990; Laspia M. F. et al., 1990; Greene W. C., 1991]. G. The и A. Gessain (1992) представили данные, указывающие на возможность циркуляции вируса HTLV- I в лимфоцитах CD4 в форме провируса. Механизм трансформации клеток

вирусами HTLV-I и II не совсем ясен. Предполагают, что продукт гена х-1ог, белок рх40, активирующий транскрипцию под действием вирусного LTR, необходим для инициации трансформации, поскольку с ним связывают акти­вацию некоторых клеточных онкогенов, включающихся в лейкомогснсз (Fu- jsawa J. et al., 1986; Seiki M. et al., 1986J. Показано, что белок px40 индуци­рует экспрессию рецепторов к интерлейкину-2 в норме регулирующеі'О про­лиферацию Т-клеток Jlnone J. et al., 1986]. В то же время с усилением свойств опухолевого фенотипа происходит полная утрата зависимости роста этих клеток от интерлейкина-2. Обнаружен и выделен фактор Т-клеточного лей­коза взрослых (ФТЛВ-тиоредоксин), продуцируемый лимфоцитами, тран­сформированными HTLV-I или вирусом Эпштейна-Барр, который действует как аутокринный ФР и синергичен интерлейкинам-1 и 2 (Wakasugi N. et al., 1990].

Полагают, что основная роль HTLV-I и II в трансформации Т-клеток сводится к инициаторной функции, а поддержание опухолевого фенотипа не зависит от их присутствия, поскольку в дальнейшем оно контролируется активированными клеточными онкогенами, т. с., по-видимому, имеет место типичный hit and run-механизм.

Y. Wano и соавт. (1988) установили, что стабильная продукция трансакти- вирующего белка p40*“HTLV-I в клетках линии Jurkatt приводит к активации и значительному увеличению уровня экспрессии специфических клеточных генов, вовлекаемых в процесс роста нормальных Т4-лимфоцитов. Количест­во таких генов, вероятно, ограничено, и они главным образом представлены гонами, кодирующими а-субъединицу высокоаффинного рецептора для ин­терлейкина-2 (Тас) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирую­щего фактора. Индукция гена интерлейкина-2 синерготически усиливается митогонами, повышающими уровень цитоплазм этического Са2*. Белок р40их не влияет на другое индуцибельные или конститутивно экспрессируемые Т- клсточные гоны. Авторы считают, что линии клеток, конститутивно экспрес­сирующих вирусный белок р40*“, могут служить моделью для изучения моле­кулярной основы его действия и выявления полного спектра клеточных ге­нов, регулируемых этим белком. Получены, в частности, сведения, указываю­щие на способность рДО1" активировать протоонкогон c-fos [Nagata К. et al., 1989].*

Использовав биологочески активные и дефектные провирусы с участком env-px — З’-LTR (кодирует три белка — Tax, Rex и р24), клонированного из клеток Т-клеточного лейкоза взрослых, A. Tanaka и соавт. (1990) в тесте трансфекции обнаружили ростстимулирующую активность гона Тах. Причем при введении в клетки крыс Rat-І этот ген индуцировал проявление туморо­генных свойств при последующей трансплантации этих клеток бестимусньгм мышам. Следовательно, ген Тах, не имеющий клеточного аналога и трансак- тивирующий транскрипцию, является онкогеном. Трансформирующая актив­ность этого гена, очевидно, осуществляется путем транскрипционного разре­гулирования механизмов контроля клеточного рос^а.

К трансдействующим ретровирусам относится и близкородственный лим- фотропным вирусам человека вирус бычьего лейкоза (BLV), вызывающий В- клеточный лейкоз и реже — Т-клеточные лимфомы. Экспрессия генов виру­сов подобного рода четко регулируется на множестве уровней, включая тран­скрипционный контроль, осуществляемый кодируемыми вирусом транс-дсй-

ствующими специфическими белками и цис-действующими последователь­ностями-мишенями JDerse D , 1987; Williams J. С. et al., 1989J.

III. Слабоонкогенныевирусыне содержат клеточных онкоге­нов, обычно компетентны по решіикации, размножаются в культурах клеток без видимых изменений и вызывают у некоторых чувствительных животных при длительном латентном периоде (иногда больше года) главным образом лимфоцитарные лейкозы. Основу этой группы составляют вирусы лейкоза птиц (ALV) и мышей (Gr-MuLV, MoMuLV идр.). Механизм трансформиру­ющего действия данных вирусов обусловливается, с одной стороны, функци­онированием их трансформирующих последовательностей, а также их спо­собностью активировать клеточные онкогены, а с другой — способностью образовывать в результате рекомбинаций с клеточным геномом экзогенный опухолеродный вирус. Показано, что место интеграции ретровируса может обусловливать определенный тип бластом атозного процесса. Например, сла­боонкогенный вирус лейкоза птиц RAV-1 вызывает разные неоплазии (лим­фомы или эритробластозы), активируя различные клеточные онкогены (соот­ветственно myc и егЬВ) путем инсерции своего LTR. Последовательность последнего оказалась практически идентичной последовательности LTR RSV |Fung Y. К. et al., 1983J. В то же время другой слабоонкогенный близкород­ственный вирус лейкоза птиц RAV-2, интеїрируя вблизи онкогена myc, инду­цирует только В-клеточный лейкоз.

Создается впечатление, что структура многих тус-ассоциированных ви­русов изменена за счет делении и дефектность провируса вследствие этого играет важную роль в онкогенезе. .Обнаружено, что все тус-ассоциирован- ные провирусы в 21 независимой опухоли содержали делении, которые были локализованы в вирусном геноме и не распространялись на прилежащие клеточные последовательности [Goodenow М. М. Hayward W. S., 1987]. Деле- ции не беспорядочны и примерно в 85% случаев у тус-ассоциированных провирусов определялись в области около 5’-конца вирусного генома, где, вероятно, расположены элементы контроля экспрессии вирусных генов. Вто­рой класс делении, затрагивающий акцепторный участок сплайсинга, кото­рый участвует в образовании вирусной env-мРНК, локализован в З'-положе- нии вирусного генома. 3'- и 5'-участки LTR тус-ассоциированных провиру­сов нс участвуют в экспрессии как и5-тус-транскриптов, так и стабильных вирусных РНК. Следует обратить внимание на то, что организация делегиро­ванных провирусов сходна с организацией делегированных неинтегрирован­ных молекул вирусных ДНК. Это подтверждает модель, согласно которой делении происходят до интеграции провируса.

С помощью рекомбинантного ретровируса EU8 была продемонстрирова­на инсерционная активация протоонкогена c-myb под действием ALV, при­водящая к индукции В-клеточных лимфом, а не миелоидных лейкозов [Kant- сг М. R. et al., 1988]. Во всех изученных опухолях вирус EU8 интегрировал вблизи гена c-myb и никогда — гена c-myc. Обычно интеграция происходила ниже сайта инициации c-myb, что приводило к образованию укороченных продуктов. В некоторых случаях EU8 интегрировал непосредственно перед кодирующей областью c-myb. Выявлены три мишени для интеїрации ALV в протоонкогены c-myb и c-myc и в локус c-bic [Clurman В. Е., Hayward W. S., 1989]. Гены c-myb и c-myc связаны с различными фенотипами лимфомы. Локус c-bic служит мишенью для интеграции в одном классе лимфом, обычно в сочетании с активацией протоонкогена c-myc. Представленные факты сви-

детельству» • что гены с-тус и с-bic моїуг действовать синергично в период лимфогенсх» и ген c-bic вовлекается в поздние стадии опухолевой прогрсс- сии.

Считаю і, что активация определенного клеточного гена (пока неизвес­тного) внутри локуса int-І или int-2 провирусом либо его LTR является необ­ходимым этапом канцерогенеза опухолей молочных желез, индуцированного MMTV. Во всяком случае показано, что экспрессия int-І в клетках молочной железы обусловливает лишь частичную трансформацию [Brown A. ct al , 19861- В качестве отрицательного контроля в этих экспериментах использо­ваны о'ч int-І, несущий мутацию со сдвигом рамки считывания. Установлено, что ген i.it-І кодирует цистеинобогащенный белок со свойствами секретиру­ющего фактора, который экспрессируется в процессе нейрогенеза у мышей и во «взрослом» яичке (Nusse R. et al., 1989J. Предполагают, что этот белок вызывает аномалии в дифференцировке в тех тканях, где он экспрессируется. Был клонирован новый высококонсервативный в эволюции ген int-4, эк­спрессирующийся при эмбриогенезе в определенные временные интервалы в специфических участках. Обнаружена инсерционная мутация локусов int-І и int-2 вирусом опухолей молочных желез мышей в предраковых поражениях и злокачественных опухолях мышей линии GR [Morris D. W. et al., 19901. Чаще всего вирусный геном MMTV интегрирован в 5 локусов ДНК опухолевых клеток мыши: wint-1, int-2, int-3, wint-З и hst-K-FGF [Callahan R. ct al., 1991).

При индукции лейкозов у мышей вирусом Mo-MuLV, провирус которого встраивается в Mlvi-І- и Mlvi-2-участки хромосом, очевидно, имеет место механизм, аналогичный онкогенезу при инфекции MMTV.

При возникновении экзогенных вирусов лейкоза мышей прежде всего следует, что родительские клетки представляют собой нспсрмиссивную сис­тему для размножения эндогенных MuLV. Вместе с тем гомологичные гены MuLV различной тропности широко комплементируют, вследствие чего с высокой эффективностью образуются патогенные рекомбинанты, часть из которых лейкозогенна. Все эти возникающие рекомбинантные ретровирусы имеют клональное происхождение. Важно, что лейкозогенные рекомбинант­ные MuLV, как правило, образуются только в результате рекомбинации в предшественниках лимфоидных клеток, содержащих интегрированные про­вирусы разной тропности. Обнаружена обратная связь между частотой возни­кновения рекомбинантных MuLV и эффективностью работы клеточных кон­тролирующих механизмов. Экзогенные лейкозогенные В-тропныс MuLV об­разуются из N-тропных эндогенных непатогенных вирусов в два этапа: снача­ла вирус «адаптируется» и может размножаться в непермиссивной системе, а затем отбираются лейкозогенные варианты. Изменение тропности MuLV обус­ловливается модификацией части последовательностей гена env, а для приоб­ретения лейкозогенных потенций необходимы изменения в 113-области LTR

Установлено, что высоким онкогенным потенциалом обладают рекомби­наты, несущие Kpnl-фрагмент генома Gr-MuLV, который включает в себя левый конец ієна env, кодирующего часть gp7(), полный полипептид р15Е и длинный концевой повтор LTR. Следовательно, онкогенностъ ассоциирована с участком, включающим правую часть гена env и часть иЗ-области LTR [Dcs Groseillers L. et al., 1983; Quint W. et al., 1984]. Показано, что транскрипци­онные сигналы в этой области (U3) могут контролировать специфичность (тип) заболеваний, индуцируемых MuLV [Chads Р. et al., 1983; Koch W et al , 1984) Например, известно, что LTR вируса Френд, образующего фокусы на

клетках легкого норки (Fr-MCF), индуцирует развитие эритроидного лейко­за, a LTR Mo-MuLV —лимфоидного. С помощью методов генной инжене­рии A. Ishimoto и соавт. (1987) установили, что развитие лимфолейкозов коррелируете присутствием энхансера Mo-MuLV. Последовательность слева и ТАТА-последовательность не существенны для типа лейкоза. Вместе с тем последовательности справа от энхансера различаются у Fr-MCF и Mo-MuLV и специфичны для лейкоза каждою типа. Комбинируя последовательности Fr-MCF и Mo-MuLV, можно создать вирус, способный трансформировать как лимфоидные, так и эритроидные клетки. Аналогичные данные были представлены Н. J. Thiesen и соавт. (1988).

Таким образом, удалось определить элементы геномов ретровирусов Френд и Молони, ответственные за различную тканевую специфичность. Кроме того, показано, что разные типы патологических нарушений, индуцирован­ных эндогенными MuLV, ассоциированы с основным гликопротеином оболо­чек вирионов — gp7(). Этот белок определяет и способность вируса размно­жаться в клетках животных разных видов. Причем механизмы индукции лейкозов одним и тем же вирусом в различных клеточных системах моїут быть неодинаковыми.

Методами генной инженерии установлено, что гоны gag и рої MuLV, в частности вируса эритролейкоза Френд, играют существенную роль в лейко- могенезе, поскольку последовательности этих гонов могут превращать неон­когенный вирус в онкогенный и усиливать патогенность вирусов, которые уже лейкомогенны (Oliff A. et al., 1985].

IV. Полноценные и дефектные неонкогенные ретровирусы (и большинство эндогенных вирусов). Следует помнить, что неонкогенные ретровирусы иногда могут внезапно приобретать онкоген- ность, рекомбинируя между собой или с онкогенными вирусами. В частнос­ти, они могут рекомбинировать с эндогенными ретровирусными последова­тельностями, представленными в клеточном геноме либо полноразмерными, либо редуцированными провирусами (Leib-M6sch С. et al., 1990; Ono М., 1990]. Например, семейство RTVL-H эндогенных рстровирусоподобных эле­ментов генома человека состоит из 1000 полноразмерных элементов и такого же количества RTVL-H-родственных LTR (Maer D. L. 1989, 1990].

Рекомбинационные акты, вероятно, представляют собой основной меха­низм приобретения эндогенным вирусом бластомогонных свойств. Кстати, в геноме кур, как свидетельствуют экспериментальные данные, по-видимому, отсутствуют эндогенные ретровирусные последовательности, рекомбинации с которыми могли бы превратить эндогенный RAV-0 в онкогенный вирус. Однако в естественных условиях такой механизм возникновения высокоон­когенного эндогенного вируса существует у мышей линии AKR и С58. При развитии спонтанного лейкоза у этих животных эндогенный AKR в первые 6 мес постнатального периода обладает очень слабой лейкозогенностью, и для его превращения в высокоонкогенный вирус необходима рекомбинация с ксенотропным вирусом [Elder J. Н. et al., 1977; Dcs Grosciller L. et al., 1983]. Считают, что такие рекомбинации между эко- и ксенотропным и вирусами играют ключевую роль в образовании высоколейкозных штаммов. Вместе с тем следует напомнить, что среди мышей низкораковых линий активная экспрессия ксенотропного вируса происходит только у особей линии NIH Swiss, в геноме которых отсутствует полноценный локус экотропного вируса.

Следует обратить внимание на то, что большинство эндогенных вирусов,

активированных различными способами, непатогенно или даже неинфскци- онно для родительскою организма. Онкогенными и инфекционными свой­ствами обладают только эндогенные вирусы, выделенные из клеток мышеи высоколейкозных и высокораковых линий, т. с. из клеток искусственно се­лекционированных по этим признакам животных. Все эти вирусы (MuLV и MMTV) экотропные, т. с. репродуцируются в клетках хозяина и поэтому способны к горизонтальной передаче. Следовательно, нельзя исключить, что свойство трансформировать клетки приобретается ими в процессе экзоген­ной инфекции. Однако высокоонкогенные вирусы сарком, как правило, де­фектны, и для их репликации требуется вирус-помощник. Исследуя экспрес­сию эндогенной вирусной информации в различных линиях клеток крыс в сравнительном аспекте, Е. М. Scolnick и соавт. (1976) пришли к заключению, что в генезе вирусов сарком существенная роль принадлежит вирусам-по­мощникам. По мнению авторов, первый этап этою процесса состоит во включении экспрессированных саркомоспецифических последовательностей РНК в частицы вируса-помощника. Эффективная трансмиссия саркомоспе- цнфической РНК требует дополнительных процессов. И, наконец, образова­ние стабильною вируса сарком путем рекомбинации между геномом вируса- помощника и частью саркомоспсцифической РНК является процессом зна­чительно более редким, чем обычное «спасение» вируса.

На модели эндогенного вируса MMTV была установлена прямая корреля­ция между уровнем экспрессии сю генома и спонтанным канцерогенезом (появлением опухолей молочных желез мышей), а также ускоренной индук­цией (канцерогенами и гормонами) этих новообразований на фоне активной продукции эндогенною MMTV [Michalides R. et al., 1979]. Однако индуциро­вать синтез эндогенною MMTV из клеток опухолей молочных желез и кле­ток гиперпластических альвеолярных узелков (ирснсопластичсские образо­вания молочной железы при «гормональном» канцерогенезе) намного легче, чем из нормальных клеток молочной железы [Me Grath С. М. et al., 1978].

Важно отмстить, что в геноме опухолевых клеток происходит амплифика­ция эндогенных провирусов MMTV, т. с. обнаруживаются дополнительные локусы интеграции эндогенных провирусов в уникальном для каждой опухо­ли участке ДНК. Причем эндогенный провирус мышей линии GR в локусе Mtv-2 определяет продукцию эндогенного вируса в молоке. Существенно, что большинство нзолятов эндогенных MMTV бластомогснно в экспери­ментальных условиях, однако они наименее патогенны для мышей родитель­ской линии [Long С. ct al., 1980]. При введении эндогенною MMTV мышам чувствительных линий этот вирус индуцирует образование гиперпластичес­ких альвеолярных узелков. Вирус GR вызывает развитие юрмонозависимых бляшек в молочной железе; клетки бляшек пролиферируют во время лакта­ции (гормональная стимуляция). Затем внутри этих бляшек формируются клоны юрмонозависимых злокачественных клеток [Bcntvclzen Р., 1972].

Нсонкогенные ретровирусы, хотя и размножаются значительно хуже он­когенных, все же потенциально могут инициировать онкогенез, используя механизм активации экспрессии клеточных онкогенов. Этот гцюцесс может осуществляться двумя путями: ретровирусы включают в свой геном онкоген и в последующем он может попадать под контроль клеточною промотора либо ретровирусы подключают свой LTR к клеточному онкогену. Надо полагать, что проретровирусы вообще могут изменять активность нс только онкогенов,

но, вероятно, и других клеточных генов. Поэтому их можно рассматривать как модуляторы широкого спектра действия.

В исследованиях последних лет убедительно показано, что наличие в цикле репликации ретровирусов сталии ДНК-провируса позволяет им выпол­нять разнообразные функции и обладать многими биологическими свойства­ми. Они являются агентами с разными патологическими потенциями, рас­пространены среди многих видов и передаются как горизонтально, так и вертикально. Ретровирусы — особые паразиты, они хорошо адаптированы к функциям хозяина: обеспечивают интеграцию, экспрессию вирусного генома и определенную кооперацию с клеточными структурами. Сами по себе они являются интермедиатами в популяции ДНК-провирусов — структурных го­мологов транспозонов других организмов. Как мутагены они могут преры­вать, модифицировать или активировать клеточные гены, встраиваясь в раз­личные участки клеточной ДНК; при этом в хозяйской ДНК появляются новые элементы, которые, как правило, стабильно наследуются.

Кроме того, ретровирусы, так же как и ДНК-содержащие опухолеродные вирусы, обладают регуляторным действием, которое осуществляется по транс­механизму на транскрипционном уровне, а не в результате интеграции в соседстве с определенными клеточными генами. Например, Mo-MuLV и Mo- MSV изменяют экспрессию генов I класса гистосовместимости мышей (МНС) и Р2-макроглобулина. Вследствие таких модуляций, в частности, резко увели­чивается количество белков H-2D, Н-2К и H-2L на клеточной поверхности, причем оказалось, что коинфекция этих клеток Mo-MSV отменяла эффект увеличения экспрессии генов МНС, обусловленный Mo-MuLV JWilson L. D. et al., 1987]. Понятно, что при этом происходят и резкие изменения в иммуно- химическом узнавании данных клеток. В качестве векторов ретровирусы способны трансдуцировать клеточные гены и функционировать как потенци­альные агенты эволюционных изменений; при этом рекомбинации вирусного и клеточного геномов могут приводить к появлению дефектных рекомбинан­тных вирусов.

Следовательно, ретровирусы могут обусловливать генетический полимор­физм и генетическую нестабильность в популяции инфицированных клеток, функционировать в качестве модуляторов геной активности, индуцировать амплификацию генов, переносить хозяйские гены и вызывать инсерциоиные мутации, т. с. они являются активными факторами изменчивости соматичес­ких клеток. Все перечисленные свойства ретровирусов были выявлены при изучении различных трансформированных клеток, служащих естественными моделями измененных соматических клеток. Вероятно, онкогенез — это лишь один из вариантов взаимодействия ретровирусов с клеткой и, возможно, данные вирусы играют важную роль в изменчивости в процессе эволюции. 3 свете обсуждаемых вопросов особый интерес представляют эндогенные про­вирусы (ретровирусные генетические элементы), являющиеся частью генома нормальных клеток большинства позвоночных, в хромосомах которых они обнаруживаются в виде множественных копий. Анализ структуры хроматина, метилирования и транскрипции этих эндогенных провирусов свидетельству­ет о том, что экспрессия их геномов находится под таким же контролем, как и других клеточных генов (Jaemisch R., 1983]. Предполагают, что новые локусы эндогенных провирусных последовательностей образуются либо при реинфекции вирусом клеток зародышевой линии, либо в результате транспо­зиции «старых» эндогенных последовательностей.

Итак, основные события (в сложной последовательной цепи и/или каска­де), происходящие в процессе вирусного канцерогенеза, следующие: 1) эк­спрессия вносимых вирусных онкогенов; 2) изменение экспрессии клеточ­ных генов, в том числе протоонкогенов, антионкогенов и генов эффекторов трансформации с помощью цис- и транс-механизма на транскрипционном уровне, а также путем подключения вирусных регуляторных последователь­ностей или активации провирусами клеточных промоторов, или вследствие значительных хромосомных перестроек, главным образом транслокаций, де­лений и амплификаций; 3) индукции еще нс идентифицированных генети­ческих изменений, приводящих к опухолевой трансформации клеток. В час­тности, представлены факты, свидетельствующие о том, что аденовирусы человека типов 2 и 12, так же как и вирусы группы герпеса, оспы и другие ДНК-повреждающие агенты, способны вызывать селективную амплифика­цию ДНК (в том числе и интегрированных последовательностей вирусов гепатита В, папилломавирусов крупного рогатого скота и др.) в дополнение к ранее известному мутагенному действию и эффекту повреждения хромосом jSchlehofer J. R., Hausen Н., 1990).

В совокупности все эти многообразные и случайные по своей природе изменения приводят к структурно-функциональным нарушениям и опреде­ленным формам совместного взаимодействия вирусных и клеточных продук ­тов. Однако опухоль, вероятно, возникает только тогда, когда происходит перепрограммирование клеточного генома, т. е. репрессируется тканеспеци­фическая программа (утрачивается контроль «созревания» и т. д.). Путем селекции таких клеток формируется стабильный опухолевый фенотип, в котором реализуется большая часть эмбриоспецифической программы и на­чинает функционировать механизм иммунологического распознавания своих собственных эмбриональных поверхностных антигенов (ЭПА-10). При этом всегда происходят различные рекомбинации геномов опухолсродных вирусов с геномами как других вирусов, так и клетки. Эта особенно ярко выраженная способность ретровирусов приводит к возникновению новых онкогенных межвирусных рекомбинантов, например вирусов типа группы MCF у мышей.

Исходя из принципиально различных механизмов бластомогенного дейст­вия опухолсродных вирусов на клетку, они могут быть сгруппированы следу­ющим образом.

1. Вирусы, содержащие онкогены как иммортализации, так и трансфор мации, т. е. интеграция этих экзогенных генов в клеточный геном необходи­ма и достаточна (при взаимодействии с регуляторными клеточными структу­рами) не только для индукции неопластической трансформации, но и для ее поддержания. К таким вирусам относятся, например, вирусы группы поли­омы и аденовирусы.

2. Вирусы, которые, помимо экзогенного клеточного онкогена, иницииру­ющего определенную стадию онкогенеза при интеграции его в хромосомную ДНК, вовлекают в этот процесс и другие клеточные онкогены, антионкогены и гены — эффекторы грансформации. Примером могут служить ретровиру­сы, онкобелки которых являются протеинкиназами, регуляторами аденилат- циклазы, аналогами ФР или их рецепторами и т. д.; локазизуются они в ядре, в цитоплазме или на клеточных мембранах.

3. Вирусы, вызывающие трансформацию по типу сложного каскадного hit-and-run-механизма с включением в онкогенез клеточных онкогенов, анти­онкогенов и генов — эффекторов трансформации, причем в большинстве

случаев вирусные трансформирующие последовательности (неклеточнои при­роды), промоторы и прочие элементы, запустившие процесс онкогенеза, мо- іут элиминироваться из клеток, поскольку они уже, как правило, не нужны для поддержания трансформированною фенотипа. Классическим примером является семейство герпесвирусов, представители которою обусловливают опухолевую трансформацию с помощью указанного механизма. Стабильная интеграция всею вирусною генома при этом варианте нс обязательна, пос­кольку вирусная ДНК необходима для инициации, но не для поддержания трансформированного фенотипа. Аналогичным механизмом трансформиру­ющего действия, вероятно, обладают папилломавирусы человека и крупного рогатого скота [Smith К. Т., Campo М. S., 1988]. В частности, показано, что белки Е6 и Е7 вируса папилломы человека (HPV16) кооперативно имморта- лизуют кератиноциты крайней плоти человека, а продукт гена Е7 того же вируса, кооперируясь с онкобелком онкогена ras, вызывает трансформацию первично трипсинизированных клеток грызунов. Установлено, что точечные мутации в гене Е7 HPV16 влияют на трансформацию, кооперацию с геном ras, трансактивацию и фосфорилирование белка Е7 [Hawley-Nelson Р. et al., 1989; Chesters Р. М. et al., 1990; Storey A. et al., 1990; Halbert C. L et al, 1991 ]. Котрансфекция антионкогена p53 (мышиным или человеческим диким ти­пом) с Е7 и онкогеном ras заметно снижала трансформацию клеток, но нс влияла на способность трансформировать мышиную клеточную линию к независимому от закрепления росту [Crook Т. et al., 1991 [. Напротив, эк­спрессия мутантного р53 сильно потенциировала трансформирующую функ­цию Е7 человеческого полиомавируса типа 16 и обеспечивала заметную независимость ФР в клетках, сотрансфсцированых Е7 и ras. Полагают, что представленные факты свидетельствуют о раздельном функционировании Е7 и р53, тем не менее комплементарными биохимическими путями. Показано также, что и белки Е6 нолимомавирусов человека серотипов 16 и 18 способ­ны связываться и формировать комплексы с р53 и эта активность коррелиро вала у Е6 различных вирусов папиллом человека с их отношением к клини чсским заболеваниям in vivo и трансформирующей пегонцией in vitro [Wer- ncss R. A. et al., 1990].

Осуществлен химический синтез полноразмерного полипептида Е7 из у/ аминокислотных остатков. Он был биологически активен и содержал как минимум два автономных функциональных домена: для индукции синтеза клеточной ДНК и для трансактивации [Rawals J. A. et al., 19901. Оказалось, что гоны Е6 и Е7 вируса папилломы человека типа 18 (HPV18) также доста­точны для индукции двухэтапной трансформации in vitro кератиноцитов че­ловека (Barbosa М. S., Schlegel R., 1989]. Трансформированные кератикоцн- ты экспрессировали мажорный ранний вирусный белок Е7, однако опухолей у бестимусных мышей не вызывали.

Определена последовательность (LCR—Е6—Е7), обусловливающая раз­личия в трансформирующей активности между HPV16 и HPV18 [Villa L. L., Schlegel R., 1991 ]. Отдельные изоляты HPV16 и HPV18 могут иметь различия в трансформирующем потенциале при выделении их из разных анатомичес­ких участков. Установлено, что у белка Е7, кодируемого рамкой генома Е7 папилломавирусов человека типов 6, 16 и 18, имеется участок из 1 7 амино кислотных остатков, высокогомологичный аденовирусному белку Е1А и боль­шому Т-антигену вируса SV40. Этот участок содержит сепаративные домены для связывания с клеточным белком гена ретинобластомы РЫ и для фосфо-

рилирования казеинкиназой II (Barbosa М. S. et al., 1990; Jones R. E et al , 1990; Hollingsworth R. E., Lee W. H., 1991 J. Причем эти два процесса являют­ся ключевым звеном онкогенного потенциала данных вирусов. В свою оче­редь обнаружено, что облаегь продукта гена РЫ восприимчивости к ретиноб­ластоме между остатками 379 и 792 необходима и достаточна для связывания и образования комплексов с большим Т-антигеном SV40 или с белками Е1А аденовирусов (Huang S. et al., 1990; Kaelin W. et al., 1990]. Эта область содержит уникальную структурную информацию, достаточную для тот, что­бы определять различие между большими Т-антигенами SV40 дикот типа и дефектного по трансформации мутанта К1. Существенно, что белки Е7 неон­когенного папилломавируса человека типа 6b(HPV6b) и опухолсродного HPV16 различаются по связыванию с белком ретинобластомы и по другим свойствам (Gage J. R. et al., 1990].

Показано, что для иммортализации нормальных эпителиальных клеток молочной железы человека и снижения их потребности в ФР достаточно экспрессии одной копии HPV16 или HPV18, интегрированных в их гоном (Band V. et al., 1990].

М Durst и соавт. (1989) предложили многоступенчатую модель канцеро­генеза эпителиальных клеток in vitro, согласно которой эпидермальные кера- тиноциты человека подвергаются иммортализации после трансфекции ДНК HPV16, однако такие клетки не являются туморогонными. Эти эпителиаль­ные клетки, иммортилизированные папилломавирусами, имели характерис­тики предмалигнизации в органотипической культуре (Blanton R. ct al., 1991 ]. Неопластическая трансформация этих культур происходит после заражения их вирусом саркомы Кирстен, содержащего активированный онкоген Ki-ras. Эффективность опухолевой трансформации под действием ras возрастает в 125 раз при обработке этих клеток гликокортикоидами.

Определена также кооперация между папилломавирусами крупного рога­того скота типа 4 и ras при морфологической трансформации первичных фибробластов крупного рогатого скота (Jaggar R. Т. et al., 1990]. Субгсном- ный фрагмент, содержащий полные Е7 и Е8 открытые рамки считывания, индуцировал трансформацию при кооперации с активированным ras. Тран­сформация была более активна, когда эти рамки находились под транскрип­ционным контролем длинного концевого повтора Mo-MuLV. Это свидетель­ствует о том, что степень трансформации зависит от уровня экспрессии данных генов.

Наконец, обнаружено, что опухолевые клетки, продуцирующие нуклеоп- ротеид Е7 HPV16, в результате трансфекции или естественным путем (в случаях многих карцином человека) могут индуцировать опухолеспецифи­ческий отторгающий эффект и служить мишенью для такого ответа (Chen L. et al., 1991 ]. Авторы считают, что эта модель может использоваться на живот­ных, с одной стороны, для исследования иммунных ответов на трансформи­рованные HPV клетки, а с другой —для оценки эффективности антипапил- ломатозных вакцин при терапии и предупреждении подобных опухолей.

Важно заметить, что наряду с уже описанными у герпесвирусов трансфор­мирующими последовательностями у вируса простого герпеса типа 2 (HSV 2) и цитомегаловируса идентифицированы трансформирующие области из 737 и 490 пар оснований, составляющие около 0,5% генома (Агеенко А. И., 1986; Spriggs D. R. et al., 1986; Buonaguro F. M. et al., 1987]. Эти сегменты не содержали открытых рамок считывания и не образовывали белковых продук-

гов. По данным секвенирования, определенная часть этих последовательнос­тей имеет структуру, аналогичную инсерционным элементам типа 1S, при­надлежащим к мобильным генам. Известно, что такие генетические структу­ры могут функционировать в качестве инсерционных мутагенов, активируя или модифицируя транскрипцию определенных клеточных генов, и в то же время выполнять функции усилителей транскрипции других генов, в частнос­ти протоонкогенов или генов эффекторов трансформации. Понятно, что иногда конечным результатом такой активации и модификации клеточных генов может быть опухолевая трансформация. Показано, что минимальный тран­сформирующий фрагмент HSV 2 mtr может действовать как комплексный промоторный элемент, а концевые сегменты EJ и ЕМ трансформирующей области Xbal-E цитомегаловируса человека способны индуцировать опухо­левую трансформацию иммортализованных клеток |Jones С., 1989; Juriwalla R. J. et al., 1989).

Что касается вируса Эпштейна-Барр (EBV), то в его геноме определен фрагмент BARF1 внутри сегмента Bam HIA, белок (латентный мембранный белок — Л МБ) которого, как считают авторы, играет существенную роль в процессе латентной инфекции и злокачественной трансформации В-лимфо­цитов, а также является фактором регуляции синтеза белка на уровне тран­сляции [Pfrzner A. et al., 1987). Затем М. X. Wei и Т. Оока (1989) показали, что трансфекция онкогена BARF1 в фибробласты мыши приводит к их ста­бильной неопластической трансформации: при инъекции новорожденным крысам трансформированные клетки инициировали образование опухолей. Методом ДНК-блот-гибридизации установлено наличие в клетках этих опу­холей гена BARF1 и методом иммуноблоттинга с применением человеческой NPC-сыворотки в этих клетках выявлена экспрессия белка с молекулярной массой ЗЗООО — раннего полипептида вируса, кодируемого геном BARF1. Получены также данные, свидетельствующие о том, что ядерный белок EBNA- 2EBV является ключевым в трансформации В-лимфоцитов [Cohen J. I. et al.,

1989) . Молекулярный анализ онкогена BARF1 показал, что интрацитоплаз- матичсский домен белка ЛМБ подвергается множественным мутациям, кото­рые могут изменять трансформирующую способность этого онкогена ггри болезни Ходжкина [Knecht Н. et al., 1992). Следует отметить, что канцероге­нез, индуцированный этим вирусом, представляет собой многт>факторный процесс, ассоциированный с активацией клеточных протоонкогенов Ha-ras, fgr, myc и др. [Arrand J. R. et al., 1988). В частности, показано, что продукт гена EBNA-2EBV вызывает индукцию протоонкогена c-fgr и, возможно, бе­лок этого гена активно участвует в иммортализации В-клеток [Knutson J. С.,

1990) .

Необходимо отметить, что, очевидно, hit-and-run-механизм в той или иной мере используется многими опухолеродными вирусами. Например, С. Chau- vin и соавт. (1990) с помощью метода Саузерн-блот-анализа исследовали опухоли мозга крыс и человека на наличие последовательностей ДНК трех групп вирусов (HSV1, SV40 и аденовируса человека типа 2). Ни в одном случае (39 опухолей) этих последовательностей не обнаружили. Полученные данные свидетельствуют о том, что указанные вирусы либо нс играют ника­кой роли в индукции этих новообразований, либо действуют по hit-and-run- механизму, либо вирусные последовательности распределены по клеточному геному в виде мелких дисперсных фрагментов, которые не удается выявить с помощью указанного метода.

4. Ретровирусы и ДНК-содержащие оиухол с родные вирусы, в частности гепадновирусы, индуцируют, вероятно, опухолевую трансформацию по тину hit-and-run-механизма, но не содержат трансформирующих областей, т. е. собственно онкогена JZahm Р., Hofschncider Р. Н., 1987). Считают, что ДНК вируса гепатита В, интсірируя в клеточный геном, активируют в основном протоонкогены семейства myc, поскольку вовлечение других клеточных ге­нов обнаруживается значительно реже в клетках рака печени человека JBucn- dia М. А., 1991]. Показано, что определенные гены вирусов этой группы являются представителями семейства трансактиваторов. Например, ген X вируса гепатита В способен стимулировать промоторы полимеразы II и III, а также длинные терминальные повторы HIV-1 и HIV-2 JAnfiero В., Schmcidcr R. J., 1990; Levreo М. et al., 1990).

Следует особи подчеркнуть, что существенная роль в опухолевой тран­сформации клеток, возникшей под действием опухолеродного вируса, как установлено, принадлежит мутациям клеточного генома по типу вставки (при интеграции провируса с хромосомной ДНК), а также активации протоонко­генов и клеточных промоторов, изменяющих, в частности, активность кле­точных генов эффекторов трансформации и антионкогенов. Все эти факты означают, что значение опухолеродных вирусов в онкогенезе не оіраничива- ется только проявлением активности продуктов вносимого ими онкогена. Основная особенность их взаимодействия с клеткой заключается в том, что они, как правило, нс вызывают гибели кістки, а изменяют генетически, внедряя свой геном в хромосомную клеточную ДНК и кооперируя с опреде­ленными регуляторными клеточными структурами и белковыми продуктами. Если провирусная ДНК интегрирует с геномом герминальных клеток, то генетические изменения могут затрагивать весь организм в целом и в некото­рых случаях при этом могут возникать эндогенные вирусы. Главная особен­ность провирусной ДНК опухолеродных вирусов состоит в том, что она обладает способностью интегрировать с различными областями клеточного генома. Иными словами, при инфекции опухолеродным вирусом практичес­ки каждая клетка становится новым вариантом генетического взаимодейст­вия.

Известно, что все опухолеродные вирусы являются модуляторами иммун­ного ответа на неопластически трансформированые клетки. Это, естествен­но, способствует формированию опухолевого узла в организме (см. главу 3).

На основании результатов детального анализа ts-мутантов вирусов поли­омы (PY) и SV40, а также многочисленных исследований, посвященных тестированию функциональной активности генов этих вирусов, можно прий­ти к заключению, что ранние участки их геномов содержат как иммортализи- рующис, так и трансформирующие онкогены | Агеенко А. И., 1986; Bolen J. В. et al., 1984; Connan G. et al., 1985; Kelly F. et al., 1986; Markland W. et al., 1986; Ito Y., Griffin В. E., 1990; Remenick J., Brady J., 1990).

Ранняя область геномов полиомавирусов кодирует синтез 3 белков: боль­шого (содержит 785 аминокислотных остатков, ММ 90 000—100 000), сред­него (соответственно 421, 55 (XX)) Т-антигенов и малого (соответственно 174—195 аминокислот и 15 000—22 000) t-антигена [Magnusson G., 1985; Wilson J. et al., 1986).

С помощью электрофореза в полиакриламидном геле и ионообменной хроматографии с использованием метода фингерпринтирования Т-антигенов вируса PY было показано, что большой и малый Т-антигены имеют 5—7

общих пептидов. Средний и малый Т-антигсны содержат два пептида, кото­рые отсутствуют в большом Т-антигене. Далее было установлено, что боль­шой и малый Т-антигены SV40 обладают одной общей антигенной детерми­нантой и одной уникальной. С помощью антисывороток, содержащих только антитела против уникальных антигенных детерминант, удалось выявить, что общие антигенные детерминанты локализованы на ЫН2-концах, а уникальные — на С-концах большого и малого Т-антигенов (Greenfield R. S. et al., 1980]. На основании всех представленных данных, можно предполо­жить, что три формы Т-антигена имеют общий МН2-конец, кодируемый в зоне 0,65—0,59 ед. генетической карты SV40, но разные СООН-концы. Уни­кальный полипептид малого t-антигена кодируется в зоне 0,59—0,54 ед. кар­ты (Martin R. G. ct al., 1979].

Анализ свойств набора Т-антигенов (большого (кодируется геном pit), среднего (кодируется геном pmt) и малого] у различных hr-t-мутантов PY показал, что все три белка также содержат общий 1ЧН2-конец из 79 аминокис­лотных остатков, а малый и средний Т-антигены имеют 112 общих аминокис­лотных остатков, относящихся собственно к зоне hr-t (Wilson J. ct al., 1986]. Особое значение имеет последовательность от 8-го до 34-го аминокислотного остатка, которая постоянно присутствует во всех гликопротеид ных гормонах гипофиза и обнаружена также в одном из белков паповавируса человека В К. С этой последовательностью связывают влияние вируса на микрофиламенты цитоскелета и морфологию клетки. Средний Т-антиген отличается от малого тем, что содержит 230 дополнительных аминокислотных остатков. В этой последовательности интерес представляют три основных фрагмента: 1) до­мен, обогащенный пролином; 2) гидрофобный «хвост», состоящий из 22 остатков и выполняющий функции «мембранною якоря»; 3) два блока кис­лых аминокислотных остатков, фланкирующих гидрофобный домен.

Т. Hunter и соавт. (1980), использовав экспериментальные и теоретичес­кие разработки, составили схему, согласно которой три ранних антигена вируса PY кодируются перекрывающимися последовательностями ДНК ви­руса PY. Все три белка имеют общую Ь4Н2-концевую часть (80 аминокислот­ных остатков), колируемую в области 74—79 ед. карты. Малый и средний Т- антигены, кроме тою, имеют 120 общих остатков, кодируемых в области 79—85 ед. карты, которых нет в большом Т-антигене. С-концевая часть среднею Т-антигсна, состоящая из 230 остатков, картируется между 86 и 99 ед. карты. Остальная часть большого Т-антигена кодируется между 86 и 25 ед. карты, перекрываясь с С-концевой областью среднею Т-антигена.

Большие Т-антигены вирусов PY и SV4O являются ДНК-связывающими мультифункциональными фосфобелками и более чем на 95% локализуются в ядре клетки; менее 5% белков находится на клеточной поверхности в ассоци­ации с плазматической мембраной. В ядре клетки различают нуклсоплазма- тический, хроматинсвязанный и ассоциированный с ящерным матриксом боль­шой Т-антиген (главным образом, гликозилированный). На плазматической мембране содержится NP4O-растворимый и NP40-нерастворимый большой Т-антиген SV40 (Schmitt М. К., Mann К., 1987].

С помощью МАТ против большою Т-антигена SV40 определены подгруп­пы антигенных детерминант на поверхности клеток, трансформированных SV4O (Ball R. К. et al., 1982]. Затем методом иммунофлюоресценции на поверхности клеток, трансформированных SV40, М. Santos и J. S. Butel (1982) идентифицировали три основных антигена: Т-антиген SV40, клеточ-

ный белок с молекулярной массой 53 000 и антигены гистосовместимости I класса (H-2D). Эти белки метили с помощью лактопероксидазного метода, затем проводили иммунопреципитацию. Авторам удалось показать, что Т- антиген на поверхности исследованных клеток находится в комплексе с указанным белком. Комплексы Н2-Т-антиген, устойчивые к действию детер­гентов, не обнаружены. МАТ как против Т-антигена, так и белка с массой 53 000 осаждали комплекс, содержащий оба белка, что свидетельствует об их прочной связи. С помощью МАТ показано, что на поверхности клеток, тран­сформированных SV40, присутствуют фрагменты как NH2-, так и СООН- коица Т-антигена. Кроме того, обнаружены структурные (или конформани­онные) различия поверхностного и ядерного Т-антигенов (Ball R. et al., 1984; Tevcthia S. S. et al., 1989J.

В эксперименте удалось установить, что экспрессия TSTA не зависит от продукции t-антигена. Оказалось, что части Т-антигена SV40 (от NH2-конца до 0,42 ед. карты) достаточно для появления TSTA на поверхности клеток (Tevcthia

S. S. et al., 1983(. Определены сайты узнавания цитотоксическими Т-лимфоци- тами наТ-антигене SV4O: сайт I локализуется между аминокислотными остатка­ми 205—210, сайты II и III — между 220—223 (сайт II может быть отделен от сайта III и локализован между остатками 225—239), сайт IV между остатками 484—503 (Tevethia S. S. ct al., 1989]. Все приведенные факты указывают на то, что ранняя область генома полиомавирусов кодирует белки, содержащие анти­генные детерминанты, которые обусловливают реакции клеточного иммуните­та, т. е. функционируют в качестве TSTA в ассоциации с антигенами гистосов­мсстимости класса I. Причем продукты генов інстосовместимости класса I служат поверх постным и рецепторами для вируса SV40 (Atwood W. J., Norkin L. С., 1989].

Оба больших Т-антигена полиомавирусов химически модифицируются по нескольким направлениям, включающим фосфорилирование (все типы Т- антигенов содержат фосфорные группы) нескольких участков (серина и ос­татков треонина), N-терминальное ацетилирование, поли-АДФ-рибозилиро- вание, гликозилирование, пальмитирование и аденилирование [Magnusson G., 1985; Butel J., larvis D. L., 1986]. Супермолекулярная структура большого Т-антигена, например SV40, представлена нативной формой, мономерами, димерами, высокогомологичиыми олигомерами и гстсроолигомсрами с р53 или белком Rb с молекулярной массой 105 000 (Butel J., larvis D. L., 1986; Dyson N. et al., 1990; Trifillis P. et al., 1990].

Анализ субклеточной локализации среднего Т-антигена вируса PY (имму- нофлюоресцснция, иммунная электронная микроскопия и применение МАТ) показал, что он ассоциирован с цитоплазматическими мембранами, к кото­рым прикрепляется гидрофобной частью аминокислот, локализующихся на С-концевом участке молекулы белка. На ранних стадиях инфекции основная часть среднего Т-антигена обнаруживается в комплексе с эндоплазматичес­ким ретикулумом. Небольшое количество этого белка выявляется на плаз­менных мембранах клетки. На поздних этапах инфекции доля среднего Т- антигсна вируса PY на плазменной мембране возрастает (Dilworth S. М., Griffin В. Е., 1983; Magnusson G., 1985]. Малый t-антиген локализуется в ядре клеток (Ito Y. et al., 1986].

Нельзя исключить, что у Т-антигенов полиомавирусов, обладающих плей- отропным действием, функционально активные формы могут различаться но степени фосфорилирования, иными словами, эти белки фосфорилируются

дифференцированно. В пользу этого свидетельствуют следующие факты. 1. Боль­шой Т-антиген фосфорил ирован во многих сайтах, причем обратимо, все фос- фопегттиды различаются по содержанию фосфора. 2. Существует корреляция между уровнем фосфорилирования и олигомеризации T-антигена. 3. Более фос­форил ированный Т-антиген активнее связывается с ДНК, т. е. данный белок фосфорил ирован в клетке в разной степени и это влияет на ею сродство к вирусной ДНК и клеточному хроматину и ДНК [Montcnarh М. et al., 1980; Scheidtmann К. Н. et al., 1982; Mohr I. J. et al., 1986]. Полагают, что фосфорили­рование Т-антигенов-инициаторов специфического связывания с ДНК регули­рует репликацию ДНК у SV40. Однако фосфорилирование Т-антигсна не требу­ется для стимуляции синтеза клеточной ДНК [Rawlins D. R. et al., 1983].

Отмечено увеличение фосфорилирования по тирозину среднею Т-антигс­на вируса PY под действием эпидермального ФР (ЭФР), что указывает на определенную связь между ними [Segawa К., Ito Y., 1983]. Получены данные, согласно которым фосфорилирование в NH,-конце большого Т-антигена SV40 нс является необходимым для стабильной трансформации клеток [Fischer- Fantuzzi L. et al., 1986]. Оказалось, что и основной сайт (тирозин-315) фосфо­рилирования в среднем Т-антигене вируса PY также не является необходи­мым для проявления трансформирующей способности вируса (Mes-Masson А. М. et al., 1984]. В то же время некоторые вирусные протеинкиназы в процессе неопластического перерождения клетки могут функционировать в комплексе с фосфопротсинкиназами — продуктами клеточных онкогенов. Например, обнаружен комплекс среднего Т-антигена вируса PY, обладаю­щий киназной активностью, с ррбОс‘*ге, который, как считают, модифицирует активность и специфичность протеинкиназы рр60с,гс при трансформации клеток этим вирусом [Smith А. Е. et al., 1983; Courtneidyc S. A., Smith A. E., 1984].

АТФазная активность выявлена только у большого Т-антигена полиома­вирусов [Clark R. et al., 1981 ]. Она не повышалась в присутствии денатуриро­ванной ДНК и снижалась при добавлении сыворотки против Т-антигена. Представлены данные о том, что АТФазная активность Т-антигена SV40 кодируется участком гена A SV40 между 0,37 и 0,29 ед. генетической карлы. Разработан тест определения этой активности с использованием МАТ, су­щественно нс ингибирующих АТФазную активность Т-аитигсна SV40. С помощью теста можно выявлять низкие уровни Т-антигена в экстрактах кле­ток, зараженных SV4O. Кроме того, Т-антиген стимулирует включение ,2Р из у-52Р-АТФ в белок [Griffin J. D. et al., 1979; Murphy С. I. et al., 1988]. По результатам электрофореза в полиакриламидном геле субстратом фосфори­лирования служит Т-антиген. Кроме того, высокоочищенный Т-антиген сти­мулировал включение фосфата в экзогенный акцептор — казеин. При мно­гостадийной очистке наблюдались параллельное обогащение препарата Т- антигеном и возрастание активности протеинкиназы, причем при седимента­ции оба компонента обнаруживались в зоне 6S. Протеинкиназа препарата Т- антигена из ts-мутанта S V40 характеризуется повышенной термолабилыюстью. Следовательно, Т-антиген обладает еще двумя ферментативными активностями — АТФазной и протеин киназной, которые ингибируются сы­вороткой против Т-антигсна [Hand R., 1981].

В инфицированных и трансформированных SV40 клетках ДНК-полиме­раза осаждается с основной массой Т-антигсна 5У40-матрикса и копреципи- тируется антисывороткой против Т-антигена [Jones С., Su R. Т., 1982]. Пред-

полагают, что между ассоциированной с матриксом ДНК-полимеразой и Т- антигеном SV4O образуется комплекс.

В настоящее время с ранней областью ДНК полиомавирусов связывают такие функции вирусного генома, как синтез ранних белков, ауторегуляцию экспрессии ранних и поздних генов, инициацию синтеза вирусной ДНК. элонгацию цепей вирусной ДНК при репликации, активацию ферментов клетки, необходимых для ее перехода из стадии покоя в стадию деления, индукцию синтеза клеточной ДНК, инициацию специфической интеграции, блокирование дифференцировки клеток, иммортализацию клеток, индукцию трансформации, изменение поверхности трансформированных клеток и, на­конец, поддержание трансформированного фенотипа клеток, который опре­деляет их способность к росту в агаровой среде, потерю контактного тормо­жения, туморогенность и другие свойства опухолевых клеток | Anderson J. L., Martin R. G., 1976; Dulbccco R., 1976; Hiscott J. B., Defendi V., 1981; Chering- ton V. et al., 1987; Murphy С. I. et al., 1988; Lawson R. et al., 19901. Оказалось, что клетки, трансформированные PY и SV40, различаются по фенотипу Использование в этих экспериментах us-мутантов позволило определить, что фенотип трансформации контролируется ранними областями геномов обоих вирусов |РсгЬа1 В., Massouldzadegan М., 1980; Thumml С. S. et al., 1981; Торр W. С., Rifkin D. В., 1981; Treisman R. etl al., 1981].

Исследование разных рекомбинантных плазмид, несущих различные учас­тки геномов полиомавирусов, показало, что большой Т-антигсн обоих ука­занных выше вирусов может им моргал изировать клетки грызуне | Assclin С., Bastin М., 1985; Glaichenhaus N. et al., 1986; Chen S., Pauch E., >90]. Мето­дами генной инженерии установлено, что биол отчее кая активное ъ, индуци­рующая иммортализацию клеток, обоих генов, кодирующих болыь >й Т-анти­ген полиомавирусов, локализована в первых 137—147 аминокислотных ос­татках с К’Н2-конца. Эта активность сильно варьировала у различных мутан­тов вследствие изменений стабильности или конформации редуцированного Т-антигена. Функции, кодируемые первыми 127 остатками (также с N-конца) и «средними» 106—114 остатками (сходен с соответствующим участком в Е1А аденовирусов) и между точками 127—250, включают в себя способность связываться с продуктом гена РЫ восприимчивости к ретинобластоме (но без сайта связывания с р53) и трансактивностью гетерологичных промоторов Оказалось, что свойство к росту, не зависимому от подложки, «разделяется» генетически от туморогенности {Cook D. N., Hassell J. А., 1990; Dyson N. et al., 1990; Thompson D. L. et al., 1990; Trifillis P. et al., 1990; Sompayrac L., Danna K. J., 1991].

Анализ в течение как минимум 20-клеточных делений многих линий показал, что экспрессия большого Т-антигсна SV40 достаточна для индукции хромосомных аберраций и изменения плоидности |Stewart N., Bacchetti S., 1991 ]. Следовательно, данный белок дестабилизирует клеточный геном, при­чем возникающие в этот момент специфические мутации могут приводить к иммортализации клеток

Средний Т-антиген вируса PY иммортализирует клетки с низкой эффек­тивностью. Это свидетельствует о том, что ген pmt обладает как иммортали- зирующими, так и трансформирующими свойствами в зависимости от систе­мы детекции. Им моргал и за ция клеток большими Т-антигенами PY и SV40 включает в себя рецессивную модификацию клеточною генома [Pereira Smith О. М., Smith J. R., 1987; Srinivasan A. ct al., 1989].

Обнаружено, что туморогенность среднего Т-антигена вируса PY обуслов­ливается наличием аланина-373, поскольку замена его на валин лишает тран­сформированные клетки способности индуцировать опухоли у животных |GeLinas С. et al., 1989]. Аналогичный эффект оказывала также замена фени­лаланина на тирозин в положении 315 [Talmage D. A. ct al., 1989]. Причем это замещение удаляет основной сайт фосфорилирования иод действием ррбО ,ге и, как было показано, является критическим этапом для связывания среднего Т-антигена PY с фосфатидилинозитол-3-киназой и в последующем для полной экспрессии трансформирующего потенциала вируса полиомы

В молекуле Т-антигена SV4O обнаружена консервативная аминокислот­ная последовательность — гомолог второму домену в белках, кодируемых EIA-областью аденовирусов человека типов 2; 4; 5; 7 и 12 и аденовируса обезьян SA7 (Moran Е., 1988]. Оказалось, что аналогичная структура находит­ся и в Т-антигене вируса полиомы. Получен химерный белок Е1 А, в котором собственный домен (с координатами 121—139 аминокислотных остатков) был замещен участком Т-антигена SV40 с координатами 101—119 остатков Показано, что этот химерный белок обладает той же трансформирующей активностью, что и природный белок Е1А аденовирусов. Химерный белок осаждался из гомогената трансформированных клеток в комплексе с теми же клеточными полипептидами, что и нормальный белок Е1А.

В трансформированных клетках грызунов ДНК полиомавирусов интегри­рует с хромосомной ДНК в неспсцифических участках по механизму запре­щенной рекомбинации. Фланкирующие участки клеточной ДНК не содержат онкогенов и подвергаются множественным перестройкам. Для неопластичес­кой трансформации необходима экспрессия ієна pmt вируса PY. Показано, что некоторые линии клеток, трансформированные вирусом PY, претерпева­ют спонтанную реверсию к нормальному фенотипу, обусловливаемую нару­шениями экспрессии гена pmt (Fried М. et al., 1986]. Такие реверсии иногда происходят вследствие одной точечной мутации в участке перекрывания ко­дирующих зон средней) и большого Т-антигенов.

Использование различных сконструированных плазмид, содержащих от­дельные фраімснтьі генов ранней области полиомавирусов, позволило уста­новить, что фрагмент большою Т-антигена SV40 с молекулярной массой 17 000 (121 аминокислотный остаток), расположенный с NHj-конца поли­пептида, достаточен для превращения клеток в бессмертную линию (иммор­тализация) и приобретения ими статуса контактной независимости. Мута­ции, затрагивающие СООН-консц молекулы Т-антигена, не влияют на им- мортализирующую активность вируса (Colby W., Shenk Т., 1982; Petite С. А. et al., 1983; Cole С. N. et al., 1986; Srinivasan A. et al., 1989]. В то же время фрагмент раннего участка генома SV40, расположенный между сайтами рес- триктаз Tag и BamHl и соответствующий экзону 2 большого Т-антигена (0,566—0,144 ед. карты) обладает способностью к полной трансформации клеток крыс линии REF52, а также клеточной линии СЗН10Т1/2. Вместе с тем считают, что экспрессия большого Т-антигена SV40 не индуцирует тумо­рогенность клеток, иммортализированных этим белком (Graessmann A., Graess­mann М., 1985; Jat Р. S. et al., 1986].

Анализ различных фрагментов среднего Т-антигена вируса PY показал, что для проявления протеинкиназной активности и способности трансфор­мировать клетки необходимы как С-, так и N-концсвые аминокислотные последовательности в молекуле этого белка. Рост клеток при низких концен-

грациях сыворотки контролируется большим Т-антигсном [Treisman R. et al., 1981; Asselin C. et al., 1983; Rassonlzadegan I. ct al., 1983; Templeton D., Eckhart W., 1984]. Дія оптимальной экспрессии опухолевого фенотипа in vivo необходимо функционирование среднего и малого Т-антигенов вируса PY [Asselin С. et al., 1984].

Таким образом, экспрессии большого или среднего Т-антиісна полиома­вирусов достаточно для развития и поддержания трансформированного фено­типа. Малый t-антиген SV40 и PY может либо усиливать трансформацию, либо вызывать различные изменения трансформированного фенотипа. Опре­делен уникальный сегмент гена t-антиген (27 аминокислотных остатков с 3'- конца), кодирующий часть молекулы этого белка, которая существенна для поддержания трансформированного фенотипа [Bikel I. et al., 1986]. Показа­но, что t-антиген участвует в разрушении сети актиновых фибрилл и индук­ции синтеза активатора плазминогена, т. с. в тех процессах, которые приво­дят к полной или максимальной трансформации [Graessman A. et al., 1980; Торр W. С., Rifkin D. В., 1980; Ito et al., 1986]. Такие клетки не прикрепляют­ся к подложке и продуцируют значительное количество протеаз. Именно перечисленными свойствами обусловливается онкогснность трансформиро­ванных клеток и, следовательно, она контролируется t-антигеном. Получены данные, позволяющие предположить, что t-антиген может функционировать как опухолевый промотор, а также трансактивировать промоторы некоторых вирусов [Торр W. С. et al., 1981; Locken М. R. et al., 1989]. Кроме того, он играет важную роль в индукции контактной независимости. Показано, что функции t-антигена и NH2-концевого фрапиента большого Т-антигена вируса PY дополняют разные функции среднего Т-антигена [Asselin G. et al., 1983].

Идентифицированы клеточные белки с молекулярной массой 27 ООО, 29 ООО, 32 ООО, 36 ООО, 51 ООО, 56 ООО, 61 ООО, 63 000 и 85 ООО. Они специфи­чески взаимодействовали с t-антиіеном вируса PY [Murphy С. I. et al., 1988; Pallas D. C. et al., 1988]. Связывание каждого из этих белков с этим антигеном было чувствительно к одной или более мутациям в t-антигене, которые дела­ли данный белок трансформационно дефектным. Наиболее чувствительным индуктором в этом отношении оказался белок с массой 85 ООО.

Мутационный анализ функций t-антиіена при продуктивной инфекции позволил I. Martens и соавт. (1989) установить, что этот белок в 10 раз увеличивает синтез вирусной ДНК, зависимый от большого Т-антигена, и является необходимым для образования инфекционных вирусных частиц. В непермиссивной же системе t-антиген необходим для морфологической тран­сформации [Rode A. et al., 1989].

Следует отметить еще одну функцию большого Т-антигена полиомавирусов — его способность реактивировать нетранскрибирующиеся («молчащие») рибосомные РНК-гены [Bascrga R. et al., 1980; Soprano К. et al., 1980]. Эти антигены, как уже отмечалось, обладают протеинкиназной и АТФазной активностью. Однако основной вопрос остается до сих пор нераз­решенным, как связать ферментативные функции с функциональной актив­ностью Т-антигенов. Установлено, что трансформирующая активность сред­него Т-антигена вируса PY связана с его способностью взаимодействовать с клеточной тирозинпротеинкиназой рр60с'*ге, т. е. с продуктом клеточного онкогена [Courtneidge S., 1985; Cheng S. Н. et al., 1986; Rassonlzadegan I. et al., 1990]. Взаимодействие между указанными белками, интенсивно активи­рующее тирозинспсцифичсскую протеинкиназную активность pp60fwc, зави-

сит от наличия p-изгиба в участке между аминокислотными остатками 177—180 молекулы Т-антигена вируса PY. Показана также абсолютная зави­симость трансформирующей активности этою белка от его способности свя­зываться с рр6(Хке. Для образования стабильного комплекса со средним Т- антигеном необходим участок между аснараіином-518 и пролином-525 (Cheng S. Н. et al., 1988]. Полагают, что средний Т-антиген вируса PY может повы­шать киназную активность белка рр6(ХЛГС путем защиты от фосфорилирова­ния. Установлено, что тирозин-527 является главным элементом С-конца, регулирующим функционирование pp60w in vivo (Cheng S. H. et al., 1988].

Показано, что участки фосфорилирования in vivo рр6(Г "c, связанного co средним Т-антигеном вируса PY в трансформированных клетках, идентичны таковым в онкобелке рр60'"’ге, синтезированною геном sre вируса саркомы Рауса. Полагают, что это связано с увеличением протеинкиназной активнос­ти ррбО*'** и трансформацией клеток вирусом PY (Cartwright С. A. et al., 1986]. С помощью нескольких рекомбинантных плазмид установлено, что уровни рр60сис влияют на характер роста и трансформацию клеток грызунов вирусом полиомы (Amini S. ct al., 1986; Schreicr A. A., Gruber J., 1990].

Обнаружено, что 15 аминокислотных остатков с С-конца и N-концсвая часть молекулы среднею Т-антигена вируса PY необходимы для взаимодей­ствия с рр6(Х,ге и последующей активации тирозинкиназы (Cook D. N., Has­sell J. А., 1990]. Анализ мутантов, имеющих делению в N-концсвой части указанною антигена, позволил выявить, что первые 6 аминокислотных остат­ков молекулы этого белка необходимы для активации киназной активно^!! ррбО11 и трансформации клеток Rati.-В последующем оказалось, ч;го сред­ний Т-антиген вируса PY способен связываться с несколькими клеточными тирозинкиназами, в том числе с рр6(Х ,гс (Cheng S. Н. et al., 1990; Wyss A. et al., 1990]. Формирование таких комплексов приводит к активации киназы и необходимо для трансформации. Существенно, что в каждом из комплексов присутствует только один тип тирозинкиназы и содержится только одна мо­лекула среднею Т-антигсна вируса PY. Это позволяет предположить, что трансформация под действием вируса PY вызывает одновременную дереіуля- цию нескольких различных путей, контролирующих клеточную пролифера­цию.

Очищенный с помощью аффинной хроматографии средний Т-антиген вируса PY в комплексе с рр6(Х,гс проявляет минимальную фосфатидилинози- толкиназную активность. Оказалось, что в этом комплексе присутствует гре- тий компонент — белок с молекулярной массой 81 (XX) (рр81). Показано, что рр81 фосфорил ирован исключительно по остаткам тирозина и в фосфорил и- рованной форме связан со средним Т-антигеном и рр6(Х ‘гс только в клетках, содержащих трансформирующие мутанты Т-антигсна, и не связан со всеми ^трансформирующими мутантами (Courtneidge S. A., Heber А., 1987]. Фос­фатидилинозитол киназная активность комплексов мутантною Т-антигена проявлялась в присутствии рр81 (рр85). Исходя из этого, авторы предполага­ют, что рр81 представляет собой фосфатдил инозитол киназу. Методом изо- элсктричсского фокусирования выявлены К) различных форм рр85, которые могут быть разделены на два семейства: рр85 и рр86 (Cohen В. et al., 1990]. Отношения между этими семействами моїуг варьировать в различных клет­ках, причем отдельные виды внутри каждого семейства могут различаться по уровню фосфорил ирован ия. Сходные формы рр85 выявлялись в ассоциации с

рр60с'ив. Осечено возрастание фосфорилирования ио тирозину в процессе трансформации под действием среднею Т-антигена PY или ррбО0 ,ге.

Итак, средний Т-антиген вируса PY формирует главным образом ком­плексы с двумя клеточными ферментами: различными тирозинкиназами, вклю­чая и рр6Ос,гс, и фосфатидилинозитол-3-киназой. Получены данные, свиде­тельствующие о том, что возрастание уровня фосфатидилинозитол-3-киназы обусловлено активацией фосфолипазы С, а также ассоциировано с актива­цией pp60c*w [Gorg F. R. et al., 1990J. Таким образом, фосфатидилинозитол-3- киназа в клетках, трансформированных вирусом полиомы, связана с ком­плексом среднего Т-антигена PY и рр60с,гс. При этом продуцируются следую­щие полифосфоинозитиды: фосфатидилинозитол-3-фосфат и фосфатидили­нозитол-3,4-бифосфат [Serunian L. A. et al., 1990].

Протеинкиназная активность связана с Т-антигеном из трансформирую­щего варианта вируса PY и отсутствует у Т-антигсна из нетрансформирую­щих hr-t-мутантов PY [Koch W. et al., 1986].

Помимо активации протеинкиназы, белка рр60с ,ге, средний Т-антиген ви­руса PY способен комплексироваться и активировать киназы рр62суе’ — про­дукт протонкогена yes и pp59c f,n — продукт онкогена c-fyn, принадлежащего к группе онкогенов, прототипом которых является c-src [Cheng S. Н. et al., 1988; Kypta R. M. et al., 1988; Kombluth S. et al., 1990]. Все указанные онкогены относятся к семейству тирозиновых протсинкиназ, что даст основа­ние считать дерегуляцию этих src-тирозиновых протеинкиназ центральным событием в механизме трансформации клеток под действием среднего Т- антигена вируса PY. Усиление киназной активности у эффекторов приводит і: фосфорилированию (модификации) клеточных факторов, уменьшая или увеличивая их активность, что в конечном счете формирует трансформиро­ванный фенотип. При этом, вероятно, существенная роль принадлежит и другим клеточным белкам, в частности белку 85 с массой 85 000 и фосфати- дилинозитолкиназной активностью. С ними также взаимодействуют средний Т-антиген вируса PY [Kaplan D. R. et al., 1988]. Вместе с тем на серии мутантов среднего Т-антигена вируса полиомы В. J. Oruker и соавт. (1990) показали, что ни тирозинкиназная, ни фосфатидилинозитол-3-киназная ак­тивность по отдельности или в комбинации нс являются достаточным услови­ем для опухолевой трансформации клеток.

Предполагают, что образование комплекса р53 — большой Т-антиген S V40 является первой фазой трансформации клеток (иммортализация) под дей­ствием этого вируса. Доказано, что вновь синтезируемые в цитоплазме боль­шой Т-антиген SV40 и р53 независимо друг от друга мигрируют в ядро. При этом р53 мигрирует туда с несколько большей скоростью, чем Т-антиген, и уже в ядре формирует стабильный комплекс со зрелой формой Т-антигена SV40 и с супер-Т-антигеном SV40 [Me Cormick F., Harlow Е., 1980; Clayton С. et al., 1982; Schmieg F. I., Simmons D. T., 1984; Schreier A. A., Gruber J., 1990]. Образование комплекса происходит достаточно быстро (в пределах 5—30 мин) и зависит от соотношения Т-антигена SV40 и р53. В этом ком­плексе обнаружено только два белка — большой Т-антиген и р53, причем оба белка соединены нсковалентными связями; р53-связывающий участок локализуется в области аминокислотных остатков 272—517 молекулы Т- антигена SV4O |Schmieg F. I., Simmons D. Т., 1988].

В трансформированных клетках комплекс локализован в ядре и на кле­точной поверхности. Т-антиген в составе комплекса фосфорилируется с боль-

шей скоростью, чем в свободной форме. Определен минимальный фрагмент большого Т-антигена SV40, который необходим для связывания с р53. Им оказался полипептид с молекулярной массой 40 ООО; его синтез начинается в точке 0,40 ед. генетической карты ДНК SV40. Белок р53 образует комплекс с Т-антигсном, коэффициент седиментации которого равен 23—25S, в то время как интактный Т-антиген обнаруживается в зоне 14—16S. Комплекс р53—Т-антиген обладал различной стабильностью в исследованных клеточ­ных линиях. Кроме того, каждая линия характеризовалась разным соотноше­нием р53 и Т-антигена в свободном состоянии и в виде комплекса [Fanning Е. et al., 1981].

Сначала комплекс р53—Т-антиген был выявлен в трансформированных SV40 и непермиссивных клетках, зараженных этим вирусом. Причем р53 осаждался сывороткой как против большою, так и малого Т-антигенов ]Run- dell К., Yang Y. С., 1981]. При продуктивной инфекции (в клетках почек обезьян) этот комплекс с помощью иммунопреципитации обнаружить не удалось до тех пор, пока не были использованы сыворотки, содержащие высокий титр антител против большого Т-антигена, а также МАТ против р53. Так, было показано, что комплекс р53—Т-антиген образуется и в литически инфицированных клетках обезьян, но при этом в комплекс включается лишь незначительная часть Т-антигена. Такой комплекс осаждается в градисіггс плотности сахарозы в зоне 20S. Комплекс 20S осаждается как антителами против большого Т-антигена, так и МАТ против р53. Инфекция кісток почек обезьян сопровождается 5-кратным увеличением скорости синтеза р53 по сравнению с таковой в незараженных. клетках, а степень фосфорилирования р53 возрастает в 30 раз [Harlow Е. et al., 1981].

В трансформированных SV40 клетках, содержащих Т-антиген, экспрес­сия р53 возрастает в 10—20 раз. В Т-антигенотрицательных (Т) рсвертант- ных опухолевых линиях и клонах клеток, полученных путем иммунологичес­кой селекции in vivo, содержались небольшие количества р53, как и в исход­ных родительских клонах. Во всех Т'-клонах, включая и высокоонкогенные, происходило быстрое разрушение р53 — период полураспада составлял 15—60 мин. Напротив, во всех Т*-клонах р53 оказался стабильным (период полурас­пада 10 ч). Корреляция между количеством р53 и туморогенностью тран­сформированных клеток отсутствовала [Mora Р. Т. et al., 1982].

В опытах по фосфорилированию р53 трансформированных SV40 кіеток было показано, что этот белок обладает протеинкиназной активностью, кото­рая, однако, незначительно снижалась при добавлении МАТ против этого белка [Jay G., Khoury G., 1980; Roy F. V. et al., 1984]. Комплекс T- антигена — p53 связывается с хроматином трансформированных кіеток, при­чем с увеличением уровня фосфорилирования Т-антигена повышается аф­финность к хроматину [Greenspan D. S., Carroll R. В., 1981]. Обнаружено, что оба белка связаны с пери- и внугрихроматиновыми фибриллами рибонукле- оиротеидов (РНП), содержащими вновь синтезированную hn-PHK [Puvion Е. et al., 1988]. Блокирование репликации вирусной ДНК приводило к диссоци­ации комплекса Т-антигена с клеточным хроматином. Связь с hn-РНП в фибриллах сохранялась. Предполагают, что связь комплекса с клеточным хроматином играет определенную роль в процессах инициации репликации, регуляции транскрипции, а также индукции и поддержания трансформации. Причем от различий в субъядерном распределении могут зависеть трансфор­мирующие и литические свойства Т-антигсна. Вместе с тем отмечено, что €*

свободный Т-антиген лучше связывается с ДНК. Этим он отличается от ком­плекса Т-антиген — р53, связывание которого с ДНК менее выражено (Sturz- becher Н ctal., 1983).

Показано, что комплекс Т-антиген — р53 из клеток почек обезьян моде­лирует биохимическую активность большого Т-антигена SV40 (Tack L. С. et al., 1989). АТФазная активность для комплекса оказалась в 18 раз выше, комплекс был также более активным в гидролизе дГТФ, дАТФ и УТФ.

J. R. Jenkins и соавт. (1988) представили данные, согласно которым Т- антиген в составе комплекса может блокировать (закрывать) последователь­ность в р53, участвующую в выполнении нормальных функций этого белка. Обнаружено также, что трансформация не зависит от активации р53 в онко­генную форму и при трансформации антипролиферативная способность р53 (белка дикого типа) блокируется Т-антигеном SV401 Jia Y. L., Simmons D. Т., 1990). Предполагают, что большой Т-антиген SV40 индуцирует или активи­рует протеинкиназу, одним из субстратов для которой служит р53 (Schei- dmann К. Н., Haber А., 1990). Определен сиквенс клеточного белка, специ­фически связывающегося с одним из участков раннего промотора SV40 и стимулирующего транскрипцию in vitro |Gaillard С., Strauss F., 1990). Соглас­но данным J. J. Manfredi и С. Prives (1990), связывание и образование гибри­дов белков р53 и plO5Rb с Т-антигенами полиомавирусов (PY и SV40) необ­ходимо, но недостаточно для проявления онкогенного потенциала этих виру­сов.

Наконец, установлено, что малый и средний Т-антигены вируса полиомы и малый t-антиген SV40 образуют стабильные комплексы с белковой фосфа- '-юй 2А (клеточный белок РР2А, ММ 36 000). Эти комплексы, очевидно, иірают важную роль в опухолевой трансформации |Pallas D ct al., 1990).

<< | >>
Источник: Агеенко А.И.. Лицо рака. — М.: Медицина,1994. — 240 с., ил. — 33. 1994

Еще по теме 1.2.3. ИММОРТАЛИЗИРУЮЩИЕ И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ДНК-СОДЕРЖЛЩИХ ОПУХОЛЕРОДНЫХ ВИРУСОВ ГРУППЫ полиомы:

  1. ЧАСТЬ 1. НЕОДАРВИНИЗМ
  2. Наследование приобретенных свойств
  3. 4. Биосинтез белка на основе генетического кода (транскрипция и трансляция).
  4. IV.6.1. Классификация генов
  5. ЛЕКЦИЯ 8 МЕДИЦИНА ХХ ВЕКА
  6. Происхождение современного человека
  7. Теория химических канцерогенов.
  8. БИОХИМИЧЕСКАЯ СИСТЕМАТИКА
  9. ПРЕДИСЛОВИЕ
  10. 1.1. МНОГОСТУПЕНЧАТОСТЬ ОПУХОЛЕВОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК IN VITRO И IN VIVO
  11. 1.2.1. ОНКОГЕНЫ ИММОРТАЛИЗАЦИИ
  12. 1.2.2. РАННИЕ ГЕНЫ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ОТВЕТА. СЕМЕЙСТВО ОНКОГЕНА МУС
  13. 1.2.3. ИММОРТАЛИЗИРУЮЩИЕ И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ДНК-СОДЕРЖЛЩИХ ОПУХОЛЕРОДНЫХ ВИРУСОВ ГРУППЫ полиомы
  14. 1.2.4. ИММОРТАЛИЗИРУЮЩИЕ И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ОПУХОЛЕРОДНЫХ СЕРОТИПОВ АДЕНОВИРУСОВ
  15. 1.2.5. ЭКСПРЕССИЯ ОНКОГЕНОВ АДЕНОВИРУСА ОБЕЗЬЯН SA7(C8) В НЕПРЕМИССИВНЫХ КЛЕТКАХ
  16. 1.2.6 ОНКОГЕНЫ ПРОМОЦИИ