<<
>>

1.2.4. ИММОРТАЛИЗИРУЮЩИЕ И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ОПУХОЛЕРОДНЫХ СЕРОТИПОВ АДЕНОВИРУСОВ

В опытах на ts- и делеционных мутантах аденовирусов, а также при использовании различных сконструированных плазмид, содержащих отде­ленные фрагменты генома этих вирусов, было четко документировано, что трансформирующая область, общая для всех серотипов, включающая 11% левого конца молекулы ДНК, состоит из 4 генов, объединенных в две незави­симые транскрипционные единицы: Е1А (1,5—4,5% генома) и Е1В (4,5—11% генома).

Они контролируют инициацию и поддержание трансформации (ЕЬ A. J. et al., 1980; Lemis J. В. et al., 1980; Byrde P. J. et al., 1982; Uo Y. S. et al., 1982; Bos J. L., Eb A. J., 1985; Evrard C. et al., 1989). Причем фенотип клеток, неопластически трансформированных этим фрагментом ДНК (11% генома), сходен с фенотипом клеток, трансформированных большими сегментами ДНК или полным вирусом. Эта область определяет морфологическую тран­сформацию клеток как высоко-, так и слабоонкогенными серотипами адено­вирусов |Агеенко А. И., 1978). Отмечена определенная аналогия трансфор­мирующих последовательностей оснований у аденовирусов человека, обезьян и других животных (Денисова Т. С., Гибадулин Р. А., 1982). Выявленное сходство, вероятно, следует объяснить функциональными особенностями этого фрагмента (11% левого конца молекулы ДНК) вирусного генома, отвечающе­го у всего семейства аденовирусов за модуляцию транскрипции вирусных и клеточных генов и за индукцию трансформированного состояния клеток.

Необходимо подчеркнуть наличие множественности форм ранних EJ А- и ЕІВ-мРНК, определяемых различиями в характере сплайсинга.

Ранняя область аденовирусного генома ЕІ А кодирует 3 перекрывающиеся mPHK-13S, 12S и 9S. На ранних стадиях инфекции с этой области считыва­ется две основные мРНК — 12S и 13S. Они образуются в результате сплай­синга из общего предшественника и различаются размерами интрона, кото­рый выщепляется из этого предшественника во время процессинга (Shen К.

Т., 1989]. Эти мРНК (12S и 13S) направляют синтез двух белков длиной в 243 и 289 аминокислотных остатков с молекулярными массами 26 000 и 32 (XX) соответственно. Данные белки отличаются друг от друга только наличием делении длиной в 46 уникальных остатков в положении 140—185 средней части 243-белка. Продукты ранней области Е1А аденовирусною генома пред­ставляют собой локализованные в ядре фосфопротеиды, содержащие не­сколько функционально различных доменов. Последние могут транскрипци- оино активировать (трансактивировать) другие ранние гены аденовирусов, иммортализироватъ первичные клетки грызунов, подавлять активность неко­торых промоторов и влиять на клеточную дифференциацию (Perricaudet М. ct al., 1979; Moran Е., Mathews М. В., 1987]. Установлено, что продукт 12S мРНК необходим для иммортализации первичных клеток грызунов. В мень­шей степени аналогичной способностью обладал и 289-белок, который также индуцировал синтез клеточной ДНК, т. е. переводил первичные культуры клеток, находящиеся в фазе Go, в фазу S клеточного цикла. Для эффективно­го преодоления блока G -S негюходимы продукты как 12S, так и 13S мРНК. Причем оба белка (из 24з и 289 остатков) имеют две функциональные актив­ности, ассоциированные с пролиферацией: одна связана с индукцией синтеза ДНК (первый консервативный домен), другая — с индукцией митозов (вто­рой консервативный домен).

Таким образом, при заражении клеток грызунов аденовирусом изменяют­ся клеточный цикл и репликация ДНК. Организация молекулы актина быст­ро изменяется через 13 ч после заражения. У инфицированных клеток фаза S начинается через 24 ч, a G2 и митоз — через 36—50 ч госле внесения вируса в культуру (Ishii К., 1987; Murphy М. et al., 1987; White Е., Stillman В., 1987]. Р. Jackson и A. J. Bellett (1989) считают, что разрушение цитосклета являстсг ранним результатом действия EIA-белков, а не прямым следствием измене­ния клеточного цикла зараженных аденовирусом клеток. Нарушения клеточ­ного цикла ассоциированы главным образом с 243-белком.

Огги выражаются в уменьшении продолжительности цикла (в среднем на 6 ч) за счет сокраще­ния фазы G, и т. д.

Показано, что 243-белок нс обязателен для продуктивной инфекции аде­новирусов в экспоненциальном росте, но в некоторых пермиссивных клетках он необходим для максимальной репликации (Roberts В. Е., 1985; Spindler К. R. et al., 1985; Guilfoyle R. et al., 1986; Ishii K., 1987; Murphy M. et al., 1987; White E., Stillman B., 1987].

В опытах на ts- и делеционных мутантах аденовирусов установлено, что сегмент Е1А, содержащий два гена иммортализации, обеспечивает постоян­ную пролиферацию клеток. Мутанты группы Е1В были дефектны в отноше­нии трансформации при обоих температурных режимах: пермиссивном и непермиссивном (Scolnick К. D., Anderson М. А., 1982; Но Р. S. et al., 1982]. Предполагают, что участок Е1В, представленный двумя генами неопласти­ческой трансформации, вовлекается как в инициацию, так и поддержание

состояния трансформации. Во всяком случае экспрессия раннею фрагмента Е1В в отсутствии функционирования Е1А недостаточна для полной тран­сформации. Продемонстрировано, что только совместная трансфекция двух транскрипционных единиц аденовирусною генома — Е1А и Е1В — приводит к опухолевой трансформации клеток и их туморогенности (Elsen Р. et а!.. 1983; Bos J. L., Eb A. J., 1985; Guilfoyle R. et al., 1986]. Обнаружено, что N- концсвая часть области El А (400 и. н.) способна к иммортализации клеток и терминирует онкогенный потенциал El-области генома аденовирусов |Bos J. L., Eb A. J., 1985].

Итак, EIA-область кодирует активное! ь, которая может обусловить пер­вичную трансформацию клеток (иммортализацию), и совместно с онкогена­ми, индуцирующими опухолевый фенотип (такими как ElB, Ha-ras и др.) может вызывать полное опухолевое превращение нормальных клеток (Mur­phy М. ct al., 1985]. Трансформирующая способность, кодируемая Е1А-об- ластью, нс обязательно должна быть связана с функцией регуляции тран­скрипции.

Показано, что продукты генов Е1А являются позитивными реіуляторами гранскрипции раннею района Е2А, ЕЗ и Е4 генома аденовирусов.

Последова­тельности, локализованные на 5*-концах ранних оперонов, содержат сайт, узна­ваемый белками El A (Weeks D. L., Jones N. С., 1983; Guilfoyle R ct al., 1986].

Обнаружено, что N-концевой участок молекул белков Е1А обладает им- мортализирующей активностью, а также способностью регулировать тран­скрипцию как вирусных, так и некоторых клеточных генов, причем каждый из продуктов генов Е1А вызывает специфические изменения спектра синте­зируемых клеточных белков. В частности, например, происходит активация экспрессии в клетках человека гена белка р53, протоонкогена c-fos, гена, кодирующею главный белок тепловою шока HSP70, генов тимидинкиназы, b-глобина, b-тубулина и др. (Grand R.J., Gallimore Р.Н., 1986; Vaessen R. T. ct al., 1986; Wu В J. et al., 1986]. Особую значимость для метаболических собы­тий, происходящих после онкогенной активации, очевидно, представляет индукция трансформирующими первым и вторым доменами белков EIА гена клеточною фермента энергетического обмена — креатинкиназы |Kaddurah- Dauk R. et al., 1990].

В клетках, трансформированных онкогенными типами аденовирусов, всегда резко снижена (на 85—90%) или выключена экспрессия антигенов МНС 1 клас­са, причем все локусы класса I подвергаются одинаковому воздействию на уровне транскрипции (Bos J.L., Eb A J., 1985; Murphy М. et al., 1985; Roberts В. E. ct al. 1985; Vaessen R. T. ct al., 1986]. Введение фрагмента El А аденовируса серотипа 5 в клетки, трансформированные высокоонкогенным аденовирусом тина 12, приводило к восстановлению экспрессии генов МНС I класса.

Показано, что клетки грызунов (крыс и хомяков), иммортализированные генами Е1А нсонкогснных аденовирусов типов 2 и 5, чувствительны к действию естественных киллеров (NK) и активированных макрофаюв. В то же время установлено, что ген Е1А аденовируса типа 12 блокирует накопление мРНК МНС I класса на уровне транскрипции, репрессируя промотор МНС (Cook L. et al., 1987; Friedman D.J., Ricciardi R.P., 1988; Meijer I. et al., 1989]. Эта функция ассоциирована с белком с молекулярной массой 47 (XX), который кодируется 13S РНК аденовируса типа 12.

Следовательно,различие в туморогенности клеток, трансформированных аденовирусами типов 5 и 12, вероятно, связано со способностью этою белка снижать Т-клсточную цитотоксичность. Блоки-

рованис генов МНС осуществляется также белком с массой 19 (XX) — продук­том гена ЕЗ, который связывает антигены гистосовмсстимости I класса в эндоплазматическом ретикулуме и тем самым предотвращает их экспрессию на поверхности клеток.

При сравнении генных продуктов EIA-области нескольких серотипов аденовирусов выявлены два высококонсервативных участка в обоих 12S- и 13S- продуктах и третий —только в 13S-продукте |Moran Е., Mathews М., 1987]. Первый домен оказался ответственным за индукцию синтеза ДНК, второй — за индукцию митоза, третий — за трансактивацию ранних вирусных генов; 67 аминокислотных остатков С-конца молекулы ответственны за быстрый тран­спорт продуктов Е1А в ядро. Помимо блокирования экспрессии генов іисто- совмсстимости, в клетках, трансформированных аденовирусами типов 5 и 12, снижается экспрессия генов c-myc, JE, коллагеназы и сгромислнзнна, на уровне инициации транскрипции. Экспрессия гена c-fos не снижается. Инги­биция экспрессии связана с функционирование генов EIA-области генома аденовирусов |Eh A. J. et al., 1989].

Методом направленною мутагенеза, получая делении, дупликации и нуклео­тидные замены в различных участках іенов El А аденовируса тина 5, J.W.Lillie и соаит.(1987)обнаружщ|и,чтообластьЗ, локализованная между остатками 142—191 молекулы 289-белка, необходима для транскрипционной репрессии, индукции синтеза ДНК иди индукции фокусообразования. Область 2 (остатки 121—136, 243-и 289-бслков)участвуств индукции і|хжус(Х)бразоваііия и транскрипционной репрессии. Мутации в области 1 (остатки 46—77,243- и 289-белков) нс влияли на ЕІ А-оносрсдованную гране крипционпую активность.

Установлено, что EIA-области белков аденовирусов, необходимые дія тран­сформации, являются участками связывания клеточных белков с молекулярной массой3(Х)(XX), 107 (XX) и 105 (XX) [Whyte Р.

ctal., 1987,1988,1989].Оказалось,что первые 127 аминокислотных остатков белка Е1А содержат последовательность, необходимую для трансформации. Следующие 12 остатков действуют как усили­тель трансЦюрмирующсй активности, а для кооперации сТ24 Ha-ras-онкоіеном необходимы два участка Е1А (остатки 1—85 и 121—138). Определены Tat же примерные координаты участков связывания клеточных белков с массой 3(Х) (XX) и 107 (ХХ)сЕ1А-полинс1Ггцлами:с(хнвстствснноК-концсвысостатки85и 121—139 Картированы также участки взаимодействия бел ков Е1А с указанными клеточны­ми белками: первые два белка связываются с участками сімггвстствснно I—76 и 121—127 (області,, абсолютно необходимая для трансформации). Что касается третьего белка с массой 105 (XX), представляющего собой продукт гена восприим­чивости к рстинобластоме, то он реаіируст с двумя раздельными участками в пол и пептидной цени молекулы белка ЕІА — между аминокилостными остатка­ми 30—60 и 121—127. Показано, что все выявлснныеучасткисвязывания белков аденовирусов Е1А необходимы язя проявления транфсормирующей способнос­ти. Следовательно, взаимодействие с определенными клеточными белками нсіЧх- ходимодзя проявления трансформирующей активности гена Е1 А. Предполагают, что белок Е1 А, взаимодействуя с продуктом гена восприимчивости кретнноб зас- томс (который, как считают, является компонеїлом реіуляторного механизма, ответственного за ишибированис пролиферации клеток), тем самым косвенно стимулирует пролиферацию клеток [Hollingsworth R.E., Lee W.H , 1991]

Установлено, что Т-антигены вирусов SV40 и полиомы человека образуют также комплексы с белком массой 107 (XX). Однако в отличие от продукт а ієна El А связывали только нсфосфорилированную форму указанного белка. С

помощью частичного протеолиза под влиянием протеазы доказано, что этот белок формировал комплекс с белком Е1А и Т-антигенами SV40 и JCY в реакции in vitro |Dyson N. et al., 1989]. Считают, что ассоциация с клеточным белком с массой 107 (XX) представляет собой один из общих этапов неопласти­ческой трансформации, опосредованной геном Е1А аденовирусов ионкогена- ми паповавирусов.

Осуществлен анализ биологических функций трансформирующей ЕА1- области аденовирусов человека |Sttfin R.W. et al., 1990]. Оказалось, что дефек­тные по трансформации мутанты аденовируса тина 5, имеющие делении на N- концс (с соответствующими аминокислотными остатками 2-36), нс могут индуцировать синтез ДНК и репрессировать транскрипцию, стимулированную инсулиновым энхансером. Функция N-концсвой области ЕА1 коррелирует со связыванием Е1 А-ассоцинрованного клеточноюбелка с молекулярной массой 300 (XX), но нс со связыванием белка с массой 105 (XX) клеток ретинобластомы. Эти факты показывают, что трансформация под действием Е1А опосредована двумя функционально независимыми областями белка N-концом и вторым доменом, взаимодействующими с разными специфическими клеточными бел­ками. Можно предположить, что белок с массой 3(Х) (XX) играет главную роль в механизмах ЕІА-опосредовакного контроля роста клеток. Сходные данные получили Т.Е.Riley и соавт. (1990). Авторы тестировали различные мутанты Е1А аденовирусов человека на способность ус транять дефект роста клеток при нспсрмиссивной температуре в системе клеточной линии tsa 14, полученной при иммортализации крысиных эмбриональных фибробластов ts-мутантом большого Т-антигсна SV40. Блок роста снимали введением большого Т- антигена SV40 дикою типа, участка Е7 вируса папилломы человека типа 16 гена Е1А аденовируса.’Было установлено, что клеточная линия tsa 14 является удобной системой для определения необходимых для компенсации дефекта роста районов Е1А-области. Показано, что таким сег ментом служит консерва­тивный участок CR1. Мутации внутри участка CR2 (необходимою для иммор­тализации первичных клеток, а также для связывания белка с массой 105 (XX) гена ретинобластомы Rb с вирусными белками) не влияют на способность к устранению дефектов роста клеток.

В зараженных и трансформированных аденовирусами клетках возникают комплексы клеточного полипептида рбО с белками Е1 А, протеинкнназой cd2 и другими клеточными киназами [Giordano A. et al., 1989]. Считают, что каждый из этих комплексов играет особую роль в регуляции клеточной) цикла

Как уже отмечалось, ранняя область аденовирусною генома Е1 В, содержа­щая два перекрывающихся гена, кодирует три белка с молекулярной массой 19 (XX) (кодируется22S и 13S мРНК), 20 (XX) (кодирующая мРНК нс идентифи­цирована) и 55 000 (кодируется 22S мРНК), отличающиеся по стартовым точкам трансляции [Bernards R. ct al., 1986]. Все три белка необходимы как для поддержания опухолевого фенотипа трансформированных клеток и их туморо генности, так и для литической инфекции: дефект по белку с массой 19 (XX) снижает способность к росту в 30 раз, а дефект по белку с массой 55 (XX) — в 3000 раз. Делении остатков 1—24,80—96 и 114—155 значительно уменьшают траксфпрмируюіііую активность белка с массой 55 (XX) аденовируса типа 12 и сю плазмид, причем туморогенность трансформированных клеток связана с остатками 80—96 молекулы этою белка [Мак I., Мак S., 1990]. Обнаружено прямое влияние белка с молекулярной массой 19 (XX) на цитоскелет, выража­ющееся в специфическом разрушении промежуточных нитей и ядерных плас-

тин [White Е., Cipriani R., 1989, 1990J. Этот белок стимулирует экспрессию генов, повышая уровень ДНК, с ним ассоциирована протеинкиназная актив­ность. Белок с массой 55 (XX), требующийся для полной клеточной трансфор­мации, способен образовывать комплексы с фосфобслком р53 [Braithwaite A.W., Jenkins J.R., 1989; HcrrmannC.H., Mathews MB., 1989; KaoJ.etal., 1990).

Помимо указанных функций, продукты El В-области ответственны за инги­бирование транспорта в цитоплазму клеточных мРНК, обеспечение транспор­та вирусспсцифичсских мРНК и за созревание мРНК El A [PilderS.etal., I986J.

Показано, что ранняя Е1 -область ответственна за сслсктившкть хромосом­ных аберраций, вызываемых аденовирусами, т. с. этот участок опрсдслсяст вирусиндуцированные повреждения хромосом JtJurman D.M. et al., 1986).

Получены данные, свидетельствующие о различиях в механизмах тран­сформации клеток вирусами полиомы, SV40 и аденовирусом типа 2 [ Bauer М. et al., 1987). Таким образом, наряду с общими этапами опухолевой трансфор­мации существуют и различные этапы.

Вместе с тем, несмотря на исключительно большой интерес к исследованию онкогенных потенций аденовирусов, содержащих как им моргал изирующие, так и неопластически трансформирующие гены, в литературе практически отсутству­ют сведения о начальных этапах взаимодействия аденовирусов с первично трин- синизированными непермиссивными клетками. Не изучена на этих системах и кинетика экспрессии ранних трансформирующих генов Е1А и Е1В аденовируса обезьян S А7 (С8), а также не исследована связь функций этих генов со структур­ными изменениями ядра, активированного к синтезу ДНК.

Hcxt^w из этого, А. И. Агеенко совместное И. Н. Котельниковой и другими соавторами (1983,19X4, 1989, 1991) предприняли попытку с помощью цитоло­гических методов охарактеризовать основные параметры (кинетика синтеза ДН К, состояние хроматина, характеризующие структурные изменения, связан­ные с матричной активностью ДНК, активность рРНКовых генов и состояние нуклеолярнои) аппарата клетки, связанных с синтезом белков) активации генома клетки-мишени с момента интеїрации вирусной ДНК, включающей только гены Е1А и Е1В приблизительно 11% генома высокоонкогенного аденовируса обезьян SA7(C8).

Д;ія этой цели использовали первично трипеинизиронанные нспермиссивные клетки эмбрио­нов мышей, оставленные в G„- и G, фазах путем лишения культур сыворотки. Изучены параметры пролиферации культур, лишенных сыворотки, активированных к синтезу ДНК 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) и вирусом в аналогичных условиях. Исследована экспрессия радних мРНК трансформирующих генов Е1А и Е1В аденовируса SA7(CX) в этой же системе.

<< | >>
Источник: Агеенко А.И.. Лицо рака. — М.: Медицина,1994. — 240 с., ил. — 33. 1994

Еще по теме 1.2.4. ИММОРТАЛИЗИРУЮЩИЕ И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ОПУХОЛЕРОДНЫХ СЕРОТИПОВ АДЕНОВИРУСОВ:

  1. 1.3. Модное поведение индивида и социальной группы в трансформирующемся обществе
  2. Студенчество является социальной группой, наиболее остро реагирующей на перемены, происходящие в современном трансформирующемся обществе. Сегодняшняя российская молодежь участвует в модернизации страны, в проведении реформ, а постоянно меняющиеся условия жизни вынуждают молодых людей приспосабливаться к новым реалиям, вести постоянный поиск новых форм идентичности, вырабатывать свою жизненную позицию. Ориентация молодежи на внешние формы идентификации заставляет ее использовать в этом случае
  3. ГЕНИЙ
  4. 1993 Неизвестный текст стихотворенияА. И. Полежаева "Гений"
  5. ГЕНИЙ
  6. 2.1.4. Генно-инженерный поворот
  7. ВСКОЛЬЗЬ о ГЕНИЯХ ИЛИ О ДЕМОНАХ 
  8. 2. Теория гения в эстетике Канта и «Моцарт и Сальери» Пушкина  
  9. 2.2. Кант о свойствах гения и анти-гений Сальери в трагедии  
  10. ПРЕДИСЛОВИЕ
  11. 1.1. МНОГОСТУПЕНЧАТОСТЬ ОПУХОЛЕВОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК IN VITRO И IN VIVO
  12. 1.2.1. ОНКОГЕНЫ ИММОРТАЛИЗАЦИИ
  13. 1.2.2. РАННИЕ ГЕНЫ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ОТВЕТА. СЕМЕЙСТВО ОНКОГЕНА МУС
  14. 1.2.3. ИММОРТАЛИЗИРУЮЩИЕ И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ДНК-СОДЕРЖЛЩИХ ОПУХОЛЕРОДНЫХ ВИРУСОВ ГРУППЫ полиомы
  15. 1.2.4. ИММОРТАЛИЗИРУЮЩИЕ И ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ ГЕНЫ ОПУХОЛЕРОДНЫХ СЕРОТИПОВ АДЕНОВИРУСОВ
  16. 1.2.5. ЭКСПРЕССИЯ ОНКОГЕНОВ АДЕНОВИРУСА ОБЕЗЬЯН SA7(C8) В НЕПРЕМИССИВНЫХ КЛЕТКАХ
  17. 1.2.6 ОНКОГЕНЫ ПРОМОЦИИ
  18. 1.2.7. ОНКОГЕНЫ НЕОПЛАСТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ. СЕМЕЙСТВО ГЕНА RAS
  19. 3.3. КОНЦЕПЦИЯ САМОПОДДЕРЖАНИЯ ОПУХОЛИ