1.2.5. ЭКСПРЕССИЯ ОНКОГЕНОВ АДЕНОВИРУСА ОБЕЗЬЯН SA7(C8) В НЕПРЕМИССИВНЫХ КЛЕТКАХ
Трансформирующие гены вируса 8А7(ишіунируют опухоли у новорожденных грызунов и нсопластичсскитраксформируют нспермиссивные клетки в культуре) расположены, как и у всего семейства аденовирусов, в крайней левой области вирусного генома, составляющей 11 % его длины, и имеют большую гомологию с онкогенами аденовирусов человека [Агеенко А.
И., 1974,1978,1986; Burnett J. Р., Harrington J.A., 1968; Kimelman D. et al., 1985J. Сегмент El, ответственный за опухолевую трансформацию, включает две группы ранних генов Е1А и Е1В, экспрессия которых необходима для эффективной трансформации клеток in vitro
и их туморогенности для животных. Поскольку экспрессия этих генов аденовируса SA7(C8) никем нс исследовалась, А. И. Агеенко и соавт. (1991) изучили этот процесс на уровне мРНК аденовирусных Д НК, соответствующих областям Е1А и Е1 В, на ранних сроках после инфекции аденовирусом обезьян SA7 (С8) первичных эмбриональных клеток мыши.
Первичные культуры эмбриональной ткани мышей.линии СВЛ выращивали на матрасах вереде 199, содержащей 10% ЭТС. В фазе монослоя из культуральной среды удаляли ЭТС и продолжали культивировать в течение 48 ч, после чего клетки инфицировали вирусом SA7. Вирус использовали в титре 10* ЦПД)0/мл, множественность инфекции составляла 1—2 ЦПД,С на клетку. Через 24 и 48 ч после инфекции клетки снимали со стекла и замораживали в жидком азоте, предварительно добавив 12% ДМСО и 10% ЭТС, затем их использовали для выделения нуклеиновых кислот. Через 24 часть инфицированных клеток инкубировали с іР-тимидином, затем проводили авторадиоіра- фию, часть клеток окрашивали AgNO\ На каждую точку просчитывали ио 3 стекла, на каждом — 100 клеток.
Для выделениям анализаРНК(блог-гибридизация)использовали методы,описанныеТ. ManiaUs и соавт. (1984). Pl 1К выде.чяли с 6-гуанидинизотиоцианатом с последующей очисткой центрифугн- рованием в градиенте С$С1; электрофорез в агарозелроводили в присутствии формальдегида.
В блот- гибридизацин в качестве зондов применяли нативную ДНК вируса SA7 (зонд SA7) и фрагменты вставки ранней области: Psll/XmaI(1990n.H.,T. — тысяча), почти точносоответствующий гену El А (зонд G) и Xmal/Xmal (1,4 т.п.н.), почти точно соответствующий гену Е1В (зонд I). Источником клонированного материала была плазмида pASP. Контролем служила гибридизация мРНК из трансформированных целой ДНК SA7 клеток крыс (линия SH2). Плазмида pASP, линия SH2, ДНК аденовируса SA7 были предоставлены Ь. С. Наро;щцким и Т. И. Тихоненко. Контрольные клетки SH2, морфологически трансформированные, туморогенные, были клонированы конечным разведением (клон SH2=C6) и постоянно поддерживалась в лаборатории генной инженерии НИИ экспериментальной гематологии и биотехнологии Всероссийского гематологического научного центра на среде ДМЕМ с 10% ЭТС. |12Р|-ДНК-зонды получали путем ни к-трансляции [ManiatisT. и др., 19841 указанных фрагментов вирусной ДНК, встроенных в плазмиду, после обработки соответствующими рестрнктазами, электрофореза в агарозе, элюции и очистки необходимых подлине фрагментов.Блот-іибридизацию проводили по методу Е. Southern(1975)с использованием нитроцеллюлозных мембранных фильтров.
Денситеметрию радиоавтографов гибридизации осуществляли на денситометре («КВ», Швеция) путем линейногосканиронания вдоль полосы электрофореза. К