1.2.6 ОНКОГЕНЫ ПРОМОЦИИ

Вторая, завершающая, стадия канцерогенеза — промоция — может бьггь следствием как клеточною отбора, так и изменений в экспрессии генома, которые моїуг обусловливаться генетическими (амплификация генов и др.) и эпигенетическими механизмами.

Некоторые промоторы не прямо активируют фермент, хотя действуют где- то в другом месте ИФ/ДГ-сигнального пути. Обнаружена двустаднйская стиму­ляция активности протеинкиназы С диацилглицеринами и эфирами форбола JBazzi M.D., Nelsestuen G.L., 1989]. Диацилглицерины участвуют в формиро­вании активной протеинкиназы С, которая остается обратимо связанной с мембранами; в этом случае добавление хелаторов Са²* стимулирует как акти­вацию протеинкиназы С, так и ее связывание с мембранами. Диацилглицерины практически неактивны в формировании конститутивно активной) необрати­мого комплекса протеинкиназы С с мембранами. Эфиры форбола активируют этот фермент как «обратимый» комплекс с мембранами и, кроме того, промо тируют конститутивную активацию фермента, формируя его «необратимый» комплекс с мембранами.

Показано, что активация нротеинкиназы С в общем случае не может быть следствием накопления в клетках диацилглицеринов или повышения концен­трации внутриклеточного свободного Са²* .!Parker PJ. et al., 1989). Различные изоформы фермента характеризуются разной чувствительностью к концентра­ции Са²* и диацилглицеринов, причем иногда наблюдается влияние природы фосфолипидов, служащих источником диацилглицеринов.

Обнаружено, что со стимуляцией нротеинкиназы С связана активация гена Egr-I (ген раннего ответа на ФР), который участвует в процессе активации транскрипции и кодирует белок, специфически реагирующий с ДНК [Seyfert

V. L. ct al., 1990]. Полагают, что продукт Egr-І представляет собой «третичный мессенджер», преобразующий сигнал активации в долговременный пролифе­ративный ответ.

Активность нротеинкиназы С резко возрастает после связывания промото­ра с рецептором,причем эти же самые рецепторы используются и эндогенными ФР. Вследствие активации этот фермента интенсивно фосфорилируются клеточные белки, в том числе и винкулин (субстрат ррбО^,тс) и рецептор ЭФР, что в совокупности приводит к нарушению межклеточною взаимодействия. Следует обратить внимание на то, что аналогичный механизм нарушения межклеточных связей возникает при реализации действия онкобелка рр6(Н^гс, т. е. через протеинкиназу С [Chia-Chcng Chang et al.< 1985]. Следовательно, нельзя исключить, что химические промоторы, например эфиры форбола и продукты онкогена src, реализуют промоторное действие одним и тем же молекулярным механизмом. Аналогичная, по-видимому, ситуация имеется и в отношении продуктов онкобелков, подобных ФР. Известно, что ЭФР и тром­боцитарный ФР (ТрФР), активирующие протеинкиназу С, благодаря связыва­ния с теми же рецепторами, что и опухолевые промоторы, также вызывают промоторный эффект.

Определена группа онкогенов промоции, белковые продукты которых, активируя протеинкиназу С, выполняют собственно роль естественных промо­торов. Важно отмстить, что эффект промоции может осуществляться и в процессе физиологической экспрессии этих генов. После завершения промо­ции функциональная активность этих генов, так же как и химических промо­торов, существенной роли нс играет. В неопластически трансформированной клетке они обычно определяются как молчащие гены, поскольку опухолевый фенотип клетки обусловливается активированным геном ras или raf и другими генами неопластической трансформации (Мойжесс Т. Г., Васильев И). М., 1986; Эрснпрейс Я. Г., 1987; Skouv J. et al., 1989]. Это имеет место даже в опухолевых клетках,трансформированных опухолеродным вирусом, содержа­щим онкоген промоции, в частности ген abl (Konopka J.B., Witte ON., 1985]. По-видимому, в силу этот обстоятельства подавляющее большинство онкоге­нов протеинкиназной группы и ФР, например ген sis, являются молчащими генами в клетках опухолей различного гистогенеза.

Итак, к онкогенам промоции относятся вирусные онкогены и прот млекопи­тающих происходит но серину-12 IGouldR.L., Hunter Т., 1988]. В последующем было показано, что, помимо опухолевых промоторов, все активаторы обмена фосфатид ил инозита (ТФР, ФР фибробластов, сыворотка, вазопрсссин,оргова- надат натрия и простагландин F,J приводят к фосфорилированию ррбО'*** по серину-12.

М. Fujii и соавт. (1989) обнаружили, что присутствие продукта upon юнко- гена c-src в транс-положении активирует клеточный ген c-fos.

Следует обратить внимание на то, что в клетках, трансформированных RS V, кроме аутофосфорилированного онкобелка, определяется более 10 гете­рогенных белков — мишеней (ММ. 36 (XX), 48 (XX), 55 (XX), 120 (XX) ит.д.) протеинкиназы рр60^гс, фосфорилирование которых осуществляется по тиро­зину,-т. с. вируссисцифичсская киназа обладает плейотропным эффектом. Среди указанных белков наиболее постоянным субстратом тирозин протеин ки­назы ррбО** является р36, относящийся к семейству аннсксинов, Са²*-фосфо- липидсвязывающих белков. Фосфобелок р36 существует в клетках в двух различных формах: мономерной (р36) и комплексированной (р36₂ pi 1₂). С помощью иммуноцитохимии и электронной микроскопии показано, что' обе формы белка р36 ассоциированы с цитоплазматической стороной мембраны ]Gerkc V., 1989]. У членов этот семейства выявлено Са^-зависимос взаимодей­ствие с фосфолипидами. Считают, что р36 может участвовать в трансформации клеток, будечи слитным с доменом c-raf-1 -киназой.

Помимо перечисленных белков, играющих, как предполагают, ключевую роль в трансформации клеток, не менее важное значение, вероятно, имеют фосфорилирующисся по тирозину белки цитоскслста. Установлено, что в клетках, трансформированных ИЗУ.фосфорилируется 1 % молекул виментина и филамина, а уровень фосфотирозина в винкулине увеличивается в 5—К) раз по сравнению с таковыми в нормальных клетках, при этом одновременно уменьшается общее содержание фосфата.

В то же время в клетках, трансформированных различными химическими канцерогенами и SV40, содержание фосфотирозина в винкулине было таким же, как и в белке нормальных клеток. Другие белки цитоскслста (филамин, а-

актинии, тяжелые цени миозина и виментин) в трансформированных клетках содержали незначительные количества фосфотирозина (Sefton В.М. et al., 1981,1982). Показано, что фосфорилирование винкулина и талина способствует освобождению этих белков из бляшек адгезии (при этом происходит их разделение) в процессе трансформации куриных фибробластов RSV (Boer А. et al., 1989). Предполагают, что фосфорилирование винкулина но тирозину может служить причиной нарушения структуры цитоскслста, прикрепления (поскольку винкулин главным образом локализуется в бляшках адгезии и участвует в прикреплении клеток к субстрату) и клеточной морфолопш. Это собственно и определяет основные признаки трансформации. Вместе с тем однозначно ответить на принципиально важные вопросы — какую функцио­нальную роль траст фосфорилирование по тирозину в трансформации клеток и собственно какие белки (цитоскелста или регуляторные) являются основны­ми мишенями вирусных фосфопротеинкиназ— к сожалению, нельзя.

Вообще о корреляции способности рр6(?^ге фосфорил ировать белки-мише­ни ио тирозину и состояния трансформации клеток данные противоречивы. Правда, подавляющее число работ, выполненных на различных тест-системах, свидетельствует о прямой корреляции между уровнем фосфопротеинкиназной активности и трансформированным фенотипом (Lee F. et al., 1981; Oppermann H. et a,., 1981; Bryant D.L., Parsons J.T., 1982). В частности, предполагают, что активация продукта протоонкогена рр6()*^гс является важным событием в возни­кновении рака толстой кишки человека (Cartwright С.A.

Получены данные, свидетельствующие отом, что Р140*“^,4р* FSV как bNH,, так и в СООН-трансформирующих областях содержит детерминанты, функци­онирующие при трансформации фибробластов, и кооперация этих двух учас­тков нс чувствительна к их разделению на уровне первичной структуры (Stone J.C. ct al., 1984). Фікфорнлированисосновного аутофосфорилируюшсгосайта (тирозин-1073) в полипептиде P130^wfp* FSV повышает как присущую этому белку активность тирозинкиназы, так и трансформирующий потенция данного белка (W'einmaster G.A. et al., 1988). Идентифицирован второй участок ауто- фосфорилирования тирозина-836, расположенный внутри не каталитической) домена SH2 Р120***^,|М, который необходим для полной протеинкиназной актив­ности этот белка.

Определены две точковыс мутации (валин-168 —> аспарагин и валин-169—> глутамин) в трансмембранном домене онкобелка Р68*’*"* вируса саркомы п гиц UR2, инактивирующие ст трансформирующую активность и вызывающие задержку связывания с мембраной (Jong S.J., Wang L.H., 1991). Полагают, что утрата бластомогенной потенции этого белка вызвана протеазной лсірадацией вследствие неправильной ассоциации ст с мембранами, поскольку трансмем­бранный домен нс только является мембранным якорем, но и направляет начачьную ассоциацию с мембранами.

Наконец, существенным этапом трансформации клеток рр6(?^,с и P6X^tnro* является, по-видимому, способность этих онкобелков фосфорилировать ино­зитолсодержащие липиды (фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат, фосфатиди­линозитол и фосфатидилинозитол-4-фосфат). Последние играют важную роль в регуляции пролиферации клеток |Michell В., 1984].

Исходя из изложенного выше, можно предпололжить, что контроль эк­спрессии онкогенов ретровирусов, ассоциированной с фенотипическим про­явлением трансформации, может осуществляться на нескольких уровнях: I) транскрипции интегрированного полного или делецированного онкогена; 2) трансляции трансформирующего белка; 3) экспрессии фосфопротсинкиназ- ной активности онкобелка; 4) транспорта онкобелка к белкам-мишеням; 5) взаимодействия онкобелка с субстратом. Вполне понятно, что при наличии такого многоступенчатого контроля конечный результат взаимодействия онко­гена с клеткой, приводящего к трансформации, может широко варьировать. Предполагают, что многообразие опухолей у животных обусловлено значи­тельным разнообразием механизмов трансформации клеток ретровирусами. Особой) внимания в этом отношении заслуживает своеобразный тип трансфор­мации определенных кроветворных клеток дефектными вирусами лейкоза птиц, выражающийся в блоке их дифференцировки. В частности, этот феномен был четко продемонстрирован на модели AEV ( Beng Н. et al., 19X2; Samarut J., GarroloL., 19X2J.

Весь материал, представленный в этом разделе, главным образом получен в экспериментах ка системе in vitro с разными ретровирусами. Что касается системы in vivo, то в этом случае также была выявлена основная закономер­ность: утрата способности вызывать опухоли коррелировала со снижением фосфбпротсинкиназой активности pp6O^,rc J Lau A.F. et al., 19X1; Bryant D. ct al., 19X2J. Вместе с тем в экспериментах на системе in vivo были получены интересные данные о разных конечных взаимодействиях одного и того же онкогена myc МС29 и МН2 с клетками, которые содержали принципиально ничем не отличающиеся провирусы указанных вирусов |Linial М., 19X2]. Предполагают, что выявленные факты обусловливались различиями в тран­скрипции провируса. Следовательно, контроль функционирования онкогенов в системе in vivo прежде всего осуществляется клеточными регуляторными механизмами и может значительно отличаться от такового в системе in vitro.

Интересны дополнительные эффекты действия онкогенов и их продуктов, хотя это пока единичные примеры. Так, белок трансформирующего гена А- MuLV с молекулярной массой 160 (XX) летально действует на клетки (Ziegler S.F. et al., 19X1]. Если же использовать мутанты этого вируса, у которых в продукте онкогена отсутствует 1/3 молекулы белка с СООН-конца в уникаль­ном фрагменте, то летальный эффект их исчезает, а клетки приобретают способность к трансформации; молекулярная масса трансформирующего он­кобелка секта в ляет 120 (XX) и ниже (Rosenberg W., Witte О., 19X0]. Точнее, как показа.1 анализ делений в различных участках гена v-abl, фрагмент с массой 45 (XX) онкобелка v-abl необходим для трансформации фибробластов и, веро­ятно, немного больший ио величине фрагмент необходим для трансформации лимфоидных клеток. Фрагмент, обладающий трансформирующей активностью, кодируется 5 -частью ієна v-abl, которая составляет около 1/3 всего онкогена v-abl (Prywes R. et al., 19X3].

Вирус саркомы Кирстен индуцирует синтез определенной нзоформы лак- іаі леї идрої спазм с молекулярной массой 35 (XX), причем продукция этого

фермента резко возрастает и в клетках, подвергшихся анаэробному стрессу. Активности лого изофермента увеличивается в 50 раз. Трансформация клеток ts-мутактами указанною вируса также сопровождается экспрессией аналогич- ной ts-изоформы лактатдегидрогеназы (Anderson Р. et al., 1981].

Следует отметить, что ЭФР, связываясь со своим рецептором на клеточной поверхности, стимулирует в мембранах клеток и цитоплазме киназу, субстратом для которой является белок с молекулярной массой 36 (XX), фосфорилирующийся по тирозину. В связи с этим уместно вспомнить, что структурно-функциональное сходство между продуктом онкогена src и ЭФРдопускает предположение, соглас­но которому ррбО** может участвовать в контроле клеточной пролиферации. Аналогичным образом связывание ТрФРс плазматической мембраной нейрог лиаль- ных клеток человека или с клетками соединительной ткани сопровождается фосфо- ' рилированием остатков тирозина в молекулах некоторых мембранных бел ков (Ghys- dael J., 1983]. Под действием ЭФР увеличиваются фосфорилирование р21а также способность этого белка связывай, гуаниновые нуклеотиды (Kamata Т., Feramisco J.R., 1984]. Предполагают, что данный онкобслок семейства генов ras может регулировать связывание молекул ФР гормональной природы с их рецепторами на поверхностной цитоплазматической мембране клеток и тем самым контролиро­вать пролиферацию.

В настоящее время можно предположить несколько механизмов действия продуктов вирусных онкогенов, стимулирующих клетки к делению. Так, про­дукт онкогена sis, высокогомологичный (В-цепи)ТрФР, может как бы подме­нять нормальный ФР и связываться с соответствующим рецептором на повер­хности клетки. После этою рецептор передает сигнал к делению внутрь клетки, который, достигая ядра, «запускает» программу, реализуемую при делении клеток. При этом важно знать, каким образом (внутри или на поверхности клеток) происходит активация клеточных рецепторов ТрФР продуктами гена' v-sis. Оказалось, что кодируемый v-sis митоген способен связываться со своим и рецепторами и активировать их внутри клеток (Fleming Т.Р. et al., 1989]. Однако для функционального сопряжения с внутриклеточной системой пере­дачи митогенных сигналов активированные рецепторы должны достичь кле­точной поверхности.

Онкоген егЬВ, который кодирует полипептид, соответствующий трансмем­бранному и внутриклеточному протеинкиназному доменам рецептора ЭФР (Downward J. etal., 1984], вероятно,способен «принуждать» клетку к делению, действуя внутри се. Иными словами, продукт гена егЬВ, по-видимому соответ­ствует активированному рецептору ЭФР.

Аналогичный механизм, очевидно, имеет место и при функционировании продукта протоонкогена пси (синонимы с-сгЬВ2 и HER2), представляющего собой тирозиновую протеинкиназу pi 85*",также родственную репеггтору ЭФР JSefton В.М., 1988; Yamada Y. et al., 1990]. Онког ен neu способен трансформи­ровать клетки только в результате мутации (но не экспрессии), замещающей валин-664 в трансмембранном домене на глутамин (замена тимина на аденин в ДНК). В результате этой мутации увеличивается киназная активность pi 85*".

В карциномах молочных желез, а также в аденокарциномах желудка и толстой кишки пациентов с плохим прогнозом обнаружена амплификация і єна neu со структурным и перестройкам и (Metzdorf R. et al., 1989; Theisinger В. et al., 1989 ].

У трансгенных мышей, клетки молочных желез которых экспрессировали активированный ген neu, множественные опухоли этого органа развивались в 1 00% случаев.

Другим субстратом действия вирусных протсинкиназ, как уже отмечалось, является винкулин, который локализуется в местах адгезии клеток, т. с. фор- с формирование, вероятно, каким-то образом через этот белок влияет на контактные взаимоотношения клеток. Показана роль вирусных фосфокиназ в изменениях гликолиза,при этом при трансформации происходит фосфорили­рование ферментов, контролирующих работу кальциевою и натриевого насоса клеточных мембран. Активация одной киназы может привести к активации другой и т. д., т. с. при трансформации происходит каскадная активация фос­фокиназ IHuntcrT., Sefton В.М., 1982; Ghysdael J., 1983].

Наконец, особый интерес представляют комплексы продуктов онкогенов как рсгровирусов, так и полиомавирусов с клеточным эмбриональным стади- оспецифическим фосфобслком (выявлены 4 участка фосфорилирования) с молекулярной массой53 ООО (MaltzmanW. etal., 1981; Berbeesi J.,Nasz I., 1983; Bendon R. et al., 1987; Levine A.J., 1990]. Интересно, что на фоне столь значительного разнообразия признаков трансформированной клетки мутант­ный фосфобслок р53 является универсальным компонентом опухолевою фе­нотипа вне зависимости от особенностей клеточной системы и природы канцерогенного фактора (вирус,химические канцерогены, спонтанная тран­сформация). Считают, что комплекс этою белка с Т-антигеном SV40 контро­лирует клеточную пролиферацию, с ею присутствием ассоциируется стимуля­ция синтеза клеточных РНК, белка и ДНК, а также переход клеток в фазу S роста | Friend С., 1983 ]. Существенно, что ген р53 (дикий тип) может выполнять и функции опухолевою супрессорною гена, контролируя клеточный цикл {Levine A.J., 1990]. Показано,- чтб клоны ДНК, соответствующие гену р53 дикого типа,способны подавлять трансформацию первичных культур фнброб- ластоподобных клеток эмбрионов крыс, вызываемую трасфекцисй генов Е1А или трансфекцией мутантных генов р53 и активированной) гена ras | Finlay С. А. et al., 1989]. Сверхэкспрессия гена, кодирующею дикий тип р53, также блокировала рост клеток остсосаркомы: отмечалась неспособность к проірессии в фазе S (Diller L. et al., 1990].

Было проведено параллельное исследование фосфотирозинсодсржащих белков и экспрессии признаков трансформации в клетках, зараженных частич­нотрансформационными мутантами RSV (Cooper J. A. etal., 1983].Оказалось, что мутация в гене sre влияет как на специфичность ррбО** по отношению к ею субстратам, так и активность самого фермента. Мутантные белки всею семей­ства онкогенов sre, в том числе и р56^1ск, приводят к возрастанию фосфорилиро­вания клеточных белков по тирозину, морфологической трансформации и не зависящему от прикрепления росту (Amrein К.Е., Sefton В.М., 1988]. Показано, что фосфотирозин значительно облегчает перенос электронов с ионов железа на N ВТ (тстразол ий нитроголубой). Этот процесс блокируется супсроксиддис- мутазой. Напротив, тирозин ингибирует перенос (Peterson D A. et al., 1988]. Следовательно, можно предположить непосредственное участие фосфотиро- зина в ускорении внутриклеточных окислительно-восстановительных реак­ций, что постулирует основную роль тирозиновых протсинкиназ в пролифера­ции клеток и трансформации путем рсіуляции переноса электронов в нс идентифицированных пока клеточных системах.

Вместе с тем фосфолированис некоторых белков ио тирозину в клетках, трансформированных RSV и А-MuLV, нс всегда причинно-слсдствснносвяза- нос экспрессией различных признаков трансформации (Cooper J. A. etal., 1983; Sefton В.М. et al., 1983]. Следовательно, вопрос о роли фосс{х)рилирования (в 8*

том числси "о тирозиновым остаткам) в нсоїиіастичсском превращении клеток пока остас