Выделение ДНК из спермы фенольным методом

В связи с тем, что представленные на экспертизу следы спермы, как правило, имеют примесь эпителиальных клеток или крови жертвы, возникает необходимость их разделения. С этой целью применяется техника "дифференциального лизиса", заключающаяся в следующем.

1. Исследуемый материал помещают в микроцентрифужную пробирку, предварительно внеся в нее 1 мл деионизированной воды.
2. Пробирку помещают в горизонтальном положении на качающуюся платформу (пробирку рекомендуется заклеить парафильмом). Выдерживают при комнатной температуре или температуре холодильника от 2 до 20 ч (в зависимости от давности пятна).
3. Удаляют предмет-носитель.
4. Центрифугируют содержимое пробирки на микроцентрифуге в течение 1 мин при 10000 - 15000 об/мин.
5. Осторожно удаляют супернатант, оставив приблизительно 50 мкл. Суспендируют осадок в оставшемся объеме. (Этот осадок содержит как сперматозоиды, так и эпителий и клетки крови.)
6. Отбирают 3 мкл взвеси, поместив ее на предметное стекло.
7. Фиксируют клетки этиловым спиртом в течение 15 мин либо путем прогревания препарата в термостате при 56 °С в течение 30 мин.
8. Наносят 1-2 капли азур-эозиновой смеси в соотношении эозин-вода-азур 1:3,5:1,5.

Выдерживают при комнатной температуре 20 мин, после чего смывают краску дистиллированной водой и микроскопируют препарат, используя объектив 90 с масляной иммерсией.

9. При обнаружении сперматозоидов проводят дальнейшее исследование. Если в препарате имеются также эпителиальные клетки, проводят процедуру дифференциального лизиса, начиная с п. 10.
   Если эпителиальных клеток (а также крови, что устанавливается микроспектральным исследованием пятна) не обнаружено, то приступают сразу к выполнению п. 15.
10. К взвеси клеточного осадка (приблизительно 50 мкл) добавляют 0,5 мл лизирующего раствора и 15 мкл 10 мг/мл протеиназы К (до конечной концентрации 0,3 мг/мл), осторожно перемешивают. Выдерживают при температуре 56 °С в течение 1-2 ч. Более короткие и более длительные сроки инкубации, чем указанные, не рекомендуются, так как могут привести либо к неполному лизису эпителиальных клеток, либо к лизису спермы.
11. Содержимое пробирки центрифугируют в течение 5 мин при 10000 -              15000 об/мин. Используя наконечник на 1 мл, переносят супернатант в чистую пробирку для исследования эпителиальной ДНК (п. 16).
12. Отмывают осадок следующим образом. Суспендируют осадок в 0,5 мл лизирующего буфера, используя вортекс. Центрифугируют в течение 5 мин при 10000 - 15000 об/мин. С помощью наконечника на 1 мл удаляют супернатант, оставив в пробирке около 50 мкл.
13. Повторяют (1—2 раза) действия, указанные в п. 12.
14. Для того чтобы удостовериться в разрушении эпителиальных клеток и извлечении спермы, готовят цитологический препарат, как описано выше, и микроскопируют его.
15. К 50 мкл спермального осадка добавляют 0,5 мл лизирующего буфера, 20 мкл 1 М раствора DTT (до конечной концентрации 40 тМ) и 15 мкл 10 мг/мл протеиназы К (до конечной концентрации 0,3 мг/мл). Выдерживают в течение 6 -18 ч при температуре 56 °С.
16. Далее фенольным методом (как описано выше) проводят отдельно депротеинизадию ДНК спермальной фракции и фракции эпителиальных клеток (см. п. 11), после чего осаждают ДНК, высушивают ее и растворяют в деионизированной воде.

Д ля концентрирования и очистки ДНК используют устройство “Центрикон-100”.