ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ПЦР-буфер
Состав реакционного буфера можно варьировать. Часто используется буфер следующего состава (концентрации указаны для 10х буфера): 0,67 М трис-НС1 (pH 8,6 - 8,8 при 20 °С); 0,166 М (NH^SO.[*]; 0,1 М 2-меркаптоэтанола.
Для стабилизации полимеразы в некоторых протоколах используют желатин, бычий сывороточный альбумин, неионные детергенты, например Tween 20.Магния хлорид
Концентрация ионов магния является определяющей для оптимизации условий ПЦР. Она влияет как на специфичность, так и на выход продуктов реакции, оказывая воздействие на целый ряд процессов: диссоциацию цепей матрицы и продуктов ПЦР, отжиг праймеров, специфичность продуктов ПЦР, образование димеров праймеров, активность фермента и точность синтеза [7]. В целом, избыток магния вызывает накопление неспецифических продуктов амплификации, а недо- статок - уменьшение выхода амплифицированных фрагментов. В реакции обычно используют от 1 до 5 тМ магния хлорида. Следует учитывать, что присутствие ЭДТА в исследуемой ДНК может изменять установленный оптимум.
Трифосфаты дезоксинуклеотидов
Трифосфаты дезоксинуклеотидов (dNTP) служат материалом, из которого в процессе ПЦР синтезируются цепи ДНК. Вводиться в реакцию dNTP должны в эквивалентных количествах. Стандартной является концентрация 200 рМ каждого из dNTP, однако используются и более низкие концентрации. Высокие концентрации dNTP (более 200 рМ) могут привести к неспецифическим результатам реакции.
Праймеры
Большинство праймеров представляют собой олигонуклеотиды из 20 - 28 ос-нований. Концентрация их в реакционной смеси обычно составляет 0,1 - 0,3 рМ. Высокие концентрации праймеров (более 0,5 рМ) могут вызвать отжиг их в несоответствующих участках ДНК и привести к накоплению неспецифических продуктов. Неспецифические продукты сами по себе являются субстратом для ПЦР, конкурируя с матрицей ДНК за полимеразу и праймеры, что приводит к более низкому выходу специфического продукта.
Taq-полимераза
ПЦР является ферментативным процессом, в котором синтез ДНК обеспечивается специфической ДНК-полимеразой. В реакции используется термостабильная полимераза, сохраняющая свою активность в высокотемпературных условиях денатурации молекул ДНК.
Для амплификации геномной ДНК Taq-полимераза используется в концентрации от 1 до 4 единиц на 100 мкл реакционной смеси. Использование более высоких концентраций фермента обычно приводит к появлению фонового "шлейфа" из неспецифических фрагментов, что затрудняет учет результатов реакции, а также к уменьшению выхода специфической последовательности. Низкие концентрации Taq-полимеразы также могут не обеспечить достаточный выход продуктов ПЦР.
ДНК
В реакции используют 10 - 100 иг ДНК. В ряде случаев возможна амплификация и меньших количеств ДНК, например 2 иг. Следует помнить, что введение избыточных количеств ДНК нежелательно, и его надо избегать.