Параметры циклов амплификации
Цикл амплификации состоит из трех фаз: денатурации, отжига праймеров и достраивания.
- Денатурация. Температура денатурации составляет 94-95 °С, время денатурации - 15 - 60 с. При неполной денатурации выход продукта уменьшен. В то же время
неоправданно длительная денатурация вызывает снижение активности фермента.
- Отжиг праймеров. Температура и время, требующиеся для отжига праймеров, зависят от состава оснований, длины и концентрации праймеров. В качестве температуры отжига для 20-членных праймеров предложено принимать минимальную из температур диссоциации каждого из праймеров. Температуру диссоциации рассчитывают по формуле [8]:
Td = 4° (G+Q + 2° (А+Т).
Если при данной температуре не обеспечивается требуемая специфичность реакции, температуру отжига повышают.
- Достраивание (синтез комплементарных цепей, экстензия, элонгация). Время достраивания зависит от длины и концентрации мишеневой последовательности и от температуры. Температура обычно варьирует в диапазоне 70 - 75 °С, традиционно составляя 72 °С (эта температура близка к оптимальной для экстензии праймеров для амплификации модельной матрицы, основанной на фаге М13). Скорость инкорпорации нуклеотидов при 72 °С составляет от 35 до 100 нуклеотидов в секунду, в зависимости от состава буфера, pH, концентрации солей, природы матрицы ДНК. Экстензия в течение 1 мин достаточна для того, чтобы синтезировать продукты длиной до 2 kb.
Для некоторых последовательностей предпочтительным является двухфазный цикл, при котором температуры отжига и экстензии совпадают. При амплификации коротких последовательностей ДНК (менее 150 п.н.) фаза экстензии может быть опущена; полноценная экстензия происходит во время перехода от отжига к денатурации [9].
Целесообразно продлевать время экстензии на ранних стадиях ПЦР при малых количествах ДНК и в конце цикла, когда концентрация продукта значительно превышает концентрацию фермента.
Удлиненная последняя экстензия (5 - 10 мин) обеспечивает полную ренатурацию цепей ДНК.Обычно амплификацию проводят в течение 30 - 35 циклов. Распространенной ошибкой является выполнение излишнего количества циклов, что ведет к появлению неспецифических продуктов.
Параметры циклов амплификации в значительной степени зависят от системы и особенностей амплификатора. Например, прибор "GeneAmp PCR System 9600" фирмы "Perkin Elmer", который имеется во многих экспертно-криминалистических лабораториях органов внутренних дел, оснащен специальной крышкой, плотно закрывающей плату с ячейками. Благодаря этому происходит равномерное и быстрое прогревание всей пробирки (включая ее крышку) и содержимое пробирки не конденсируется на внутренней поверхности. Это дает возможность работать без минерального масла, а также использовать короткие циклы амплификации. Последнее достигается также за счет использования специальных тонкостенных пробирок, значительно сокращающих время прогревания.
В настоящее время выпускается большое количество моделей амплификаторов, в том числе отечественного производства.
Требования к амплификатору:
- прибор должен обеспечивать непрерывность циклов в заданном режиме;
- скорость охлаждения должна составлять не более 1 град/с, нагревания - не более 1,5 град/с;
- отсчет времени должен начинаться при достижении заданной температуры; 4)
разница температур в разных ячейках должна быть минимальной.
Необходимо быть уверенным, что температура, которая высвечивается на дисплее амплификатора, соответствует температуре содержимого пробирок. У многих систем амплификаторов на дисплее высвечивается температура платы, при этом температура амплификационной смеси может значительно от нее отличаться. Поэтому, приступая к работе на новом приборе, следует провести контрольное измерение температуры в ячейках. Если реальная температура ниже температуры на дисплее и не удается провести
корректировку показаний дисплея, необходимо задавать более высокую температуру, чем указано по методике, и контролировать режим работы амплификатора с помощью термометра.
В качестве термометра рекомендуется использовать специальный датчик, позволяющий измерять температуру непосредственно в пробирке, помещенной в ячейке платы. Пробирка должна быть того же образца, который используется при проведении амплификации.Следует также измерить температуру в разных ячейках платы и, если она существенно различается, использовать те ячейки, в которых температура наиболее близка к заданной. Пробы, относящиеся к одной и той же экспертизе, а также все контрольные пробы необходимо помещать в ячейки с одинаковой температурой.
Приступая к работе на новом амплификаторе, необходимо провести оптимизацию условий ПЦР.
В табл. 1,2 приводятся протоколы ПЦР для трех VNTR-локусов.
Таблица /
Примерная схема ПЦР для амплификации аллелей VNTR-локусов АроВ, D17S30, D1S80
| Компонент | Исходная | Концентрация | Объем, |
| реакционной смеси | концентрация | в реакционной смеси | мкл |
| Деионизированная вода Буфер Магния хлорид | юх 50 тМ | Iх 3 тМ (АроВ) 2 тМ (D17S30) 2 тМ (D1S80) | 12,3 2.5
|
| Смесь dNTP Праймер Праймер Taq-полимераза ДНК | 10 тМ 5 рМ (1 о.е./мл) 3 5 jиМ (1 о.е./мл) 5 ед/мкл 0,1 мкг/мкл | 0,8 тМ 0,3 рМ 0,3 рМ 1 ед/25 мкл | 2,0 1.5
|
| Общий объем реакционной смеси |
|
| 25,0 |
Таблица 2
Примерные параметры циклов амплификации
| Фаза | Температура, °С | Длительность, мин | Количество циклов |
| Программа 1: |
|
| 1 |
| начальная денатурация | 94 | 3 |
|
| Программа 2: |
|
| 30-35 |
| денатурация | 94 | 0,5-1 |
|
| отжиг праймеров | 57 (АроВ) | 0,5-1 |
|
|
| 57 (D17S30) |
|
|
|
| 64 (D1S80) |
|
|
|
| 72 | 1 |
|
| достраивание цепей |
| Л |
|
| Программа 3: | 72 | 5-10 | 1 |
*
Концентрация праймеров обычно указывается изготовителем в оптических единицах (о.е.).
Для перевода о. в jиМ используют следующую формулу:концентрация (jиМ) = концентрация (о.е.)/0,01 N, где N - число нуклеотидов в праймере.
При постановке реакции амплификации необходимо проведение контрольных исследований. Они включают в себя:
- исследование ДНК, выделенной из образцов с известным генотипом по исследуемым локусам;
- исследование пробы с реакционной смесью без ДНК (контроль за загрязнением реагентов).