ОЦЕНКА ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ
Продукты ПЦР при исследовании VNTR-локусов оценивают путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле (ПААГ). В целом, выбор метода электрофореза определяется несколькими обстоятельствами.
Так, полиакриламидный гель обладает большей разрешающей способностью, чем агарозный. Это делает его использование предпочтительным при исследовании локусов, в которых близкие аллельные варианты имеют лишь незначительную разницу в длине последовательностей. Например, соседние аллели локуса D1S30 отличаются весьма существенно - на 70 п.н. - и вполне могут быть дифференцированы в агарозном геле. Аллели же локуса D1S80 отличаются друг от друга не более чем на 16 п.н., поэтому хотя и могут быть дифференцированы в агарозном геле, более четкий результат получается в ПААГ. Типирование локусов, аллели которых имеют различия по нескольким нуклеотидам, не может быть осуществлено посредством электрофореза в агарозном геле.Другим обстоятельством, влияющим на выбор метода электрофореза, является чувствительность используемой окраски. Так как окраска серебром обладает большей чувствительностью по сравнению с окраской бромистым этидием, при исследовании объектов судебно-биологической экспертизы первая нередко имеет преимущества.
Следует также отметить, что электрофорез в ПААГ в ряде случаев позволяет получить более специфичные результаты, чем электрофорез в агарозном геле.
Таким образом, электрофорез в ПААГ с окраской серебром в целом более эффективен, чем электрофорез в агарозном геле с окраской бромистым этидием.
Тактически целесообразно при типировании любого локуса начинать электрофоретическое исследование с пробного электрофореза в агарозном геле. Результаты его позволяют эксперту сориентироваться и определиться в отношении необходимости проведения более трудоемкого исследования с использованием ПААГ. Пробный электрофорез предназначен прежде всего для того, чтобы удостовериться, что в исследуемых объектах выявляются амплифицированные фрагменты и что данная ПЦР-система работает специфично.
Результат реакции может позволить сделать вывод и без дополнительного исследования с использованием ПААГ. При необходимости уточнения результата следует дополнить исследование гель-электрофорезом с использованием ПААГ с окраской бромистым этидием или серебром. При исследовании локуса D1S30 (pYNZ 22) фракционирование обычно проводят в агарозном геле; при исследовании локуса D1S80 (рМСТ 118) - в ПААГ; при исследовании локуса АроВ - в агарозном геле или в ПААГ.Концентрация агарозы для исследования амплифицированных фрагментов зависит от размера анализируемых последовательностей. При исследовании указанных VNTR-локусов используют 2-4 % агарозу.
Существует большое количество методик электрофореза в ПААГ. Здесь мы приводим одну из них, но возможно использование и других модификаций. Основным требованием к методике является достаточное разрешение, что достигается соответствующей разгонкой. Разгонка должна быть такой, чтобы обеспечивать четкую дифференциацию двух соседних аллелей. Например, для локуса D1S80 "Perkin Elmer" рекомендует использовать гель длиной не менее 32 см. Физические параметры электрофореза - напряжение, ток, а также время электрофореза зависят от размеров электрофорезной камеры, ее конструкции, наличия или отсутствия системы охлаждения и т. д. При выборе величины тока следует учитывать то обстоятельство, что при слишком медленном движении фрагментов по гелю может быть весьма ощутим эффект диффузии, что приводит к отсутствию четкости сигнала или даже к исчезновению его по мере прохождения ДНК по гелю. В то же время слишком большой ток, обеспечивая достаточную скорость движения фрагментов ДНК, вызывает перегревание геля, что, в свою очередь, также ухудшает результат. Поэтому следует выбирать те параметры, которые, позволяя производить разгонку максимально быстро, не оказывают неблагоприятного воздействия на ДНК.
В настоящее время появились новые методы электрофореза. К таковым относится, например, электрофорез с использованием автоматической "Phast’'-системы фирмы "Pharmacia" в мини-гелях. Принципиально новым методом является капиллярный электрофорез. Перечисленные методы пока не нашли применения в практике экспертизы; возможности использования их изучаются.