Электрофорез в ПААТ с окрашиванием серебром
Заливка 8 %-ного гая Пропись для геля размерами*4
250x200x0,8 (мм): 210x400x0,8 (мм):
Акриламид/бисакриламид 8 мл 19 мл
ЮхТВЕ Змл 7 мл
Глицерин 2 мл 5 мл
TEMED 20 мкл 70 мкл
Персульфат аммония 6,5 мл 1 мл
Деионизированная вода Д° 20 мл Д° 70 мл
Размеры геля даны в соответствии с размерами электрофорезных камер, имеющихся в настоящее время в большинстве ДНК-лабораторий ОВД.
Быстро, но очень тщательно перемешивают смесь и выливают ее в пространство между стеклами. Помещают гребенку. После полной полимеризации геля вынимают гребенку, промывают карманы 1 хТВЕ-буфером, устройство устанавливают в электрофорезной камере, наливают электродный буфер (1 хТВЕ) и подключают камеру к сети. Электрофорез проводят при 250 В/50 А в течение 4 ч при исследовании локуса D1S80 и при 130 В/ 30 А в течение 18 ч при исследовании локуса АроВ.
Окрашивание геля
Окрашивание геля производят в кювете, которую помещают на качающуюся платформу. Этапы окрашивания приведены в табл. 3.
Таблица 3
Окрашивание ПААГ нитратом серебра
| № | Раствор | Время, | Примечание |
| п/п |
| мин |
|
| 1 | Дистиллированная вода | 2 |
|
| 2 | 10 %-ный этанол | 5 |
|
| 3 | 1 %-ная азотная кислота | 3 |
|
| 4 | 0,012 М раствор серебра нитрата | 20 | Кювета должна быть закрыта от света |
| 5 | Дистиллированная вода | 1 |
|
| 6 | 0,28 М раствор натрия карбоната + 0,037 %-ный раствор формалина | До проявления полос | Промывание проводить в трех |
|
|
| порциях раствора (перед использованием раствор | |
| 7 | Дистиллированная вода | 1 | рекомендуется охладить) |
| 8 | 10 %-ный раствор уксусной кислоты | 5 |
|
| 9 | Дистиллированная вода | 2 |
|
Окрашенные фрагменты ДНК определяются в геле в виде темно-желтых полос, расположенных на сероватом фоне. После того как гель окрашен, его помещают на плотную фильтровальную бумагу, фотографируют или сканируют.
При необходимости сохранения геля его высушивают с помощью драйера и хранят при комнатной температуре. Если драйера нет, гель помещают на стекло или другую плотную поверхность и накрывают тонкой полиэтиленовой пленкой. В таком виде гель может храниться в холодильнике при 4 - 8 °С несколько недель. Периодически его следует смачивать водой. Со временем полосы становятся менее яркими, изменяется цвет фона.Идентификацию аллелей производят, сравнивая выявленные фрагменты по уровню расположения с фрагментами контрольных лэддеров. При наличии соответствующей программы выполняют компьютерную обработку результатов исследования. На основании данных о частотах встречаемости аллелей производят расчет вероятности случайного совпадения выявленных признаков. Методика математической обработки результатов ДНК-анализа, а также вопросы, связанные с интерпретацией полученных данных, рассматриваются в методических рекомендациях [10].