Оценка активности ацетилхолинэстеразы в Т-клетках
Для определения активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в Т- клетках тимуса и селезенки используют метод выделения популяции Т-лимфоцитов с максимальной активностью АХЭ из ядросодержащих клеток органов в градиенте плотности перколла (удельная плотность
составляла 1,065).
Клетки отмывают в 0,1 молярном фосфатном буфере (pH-8,0) и подсчитывают содержание лимфоцитов в суспензии. Выделенные таким образом клетки составляют около 80% Т-лимфоцитов «низкой плотности», характеризуются высокой активностью АХЭ [Szelenyi J.G., et al., 1982]. Активность АХЭ определяют по методу [Ellman G.M., et al.., 1961]. К 1,5 мл суспензии, содержащей 1-5-108 клеток в 1 мл 0,1 молярного фосфатного буфера (pH -8,0), добавляли 20 мкл 0,075 моль ацетилхолина иодида и 50 мкл 0,01 моль дитио-бис-нитробензойной кислоты. После 20 мин инкубации при 25° С реакцию останавливают добавлением 100 мкл 1,5-дифтор-2,4-динитробензола и регистрируют увеличение оптической плотности спектрофотометрически (420 нм) [Szelenyi J.G., et al., 1982]. За единицу активности АХЭ (Ед) принимают мкмоль ацетилхолина, гидролизованного за 1 мин в мл суспензии, содержащей 109 Т-лимфоцитов [Kutty К. М. et al., 1976]. Учитывая зависимость антителогенеза от перераспределенияиммунокомпетентных клеток между лимфоидными органами [Maslinski W. К et al., 1987; Tiefenbach В., Wichner S., 1985], подсчитывают число ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке после их выделения из органов в среду № 199 путем подсчета в камере Горяева через 4 сут (могут быть, в зависимости от задачи исследования, выбраны и иные сроки) после иммунизации (через 1 и 2 сут после введения последней дозы АХ и холинотропных веществ соответственно). Число Т- и В-лимфоцитов в тимусе и селезенке определяют по методике |Thomas I.K., Imamura Т., 1986], а активность АХЭ - по описанному методу [Ellman G.M., et al.., 1961, Szelenyi J.G., etal., 1982].
2.10.