ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНОВ РАЗЛИЧНОЙ УГЛЕВОДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ НА ГЕМОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕМОЦИТОВ МИДИИ MYTILUS EDULIS

А.Н. Сухачев ^1,2, И.В. Кудрявцев ^1,2, К.Е. Николаев ³, К.В. Галактионов ³,

А.Д. Харазова ², А.В. Полевщиков ¹

¹ ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, г.

³ Зоологический институт РАН, г. Санкт-Петербург

e-mail: ovechka21@yandex.ru

Распознавание углеводных детерминант на поверхности патогена играет важную роль в сис­теме защитных реакций врожденного иммунитета различных групп животных. В настоящее время углевод-распознающие рецепторы, равно как и скевенджер- и толл-подобные рецепторы, относятся к группе паттерн- распознающих молекул, которые связываются со специфическими молекулярны­ми паттернами (известными как ассоциированные с патогенами молекулярные паттерны или ПАМП) определенных микроорганизмов. Результатом подобного рода взаимодействий является ак­тивация клеточных и гуморальных эффекторных систем, направленных на элиминацию патогена из внутренней среды организма. У беспозвоночных основная функциональная нагрузка по распознава­нию и уничтожению патогена приходится на циркулирующие клетки гемолимфы - гемоциты. Ге­моциты различных представителей моллюсков несут на своей поверхности широкой спектр угле- вод-распознающих рецепторов, которые играют ведущую роль в распознавании микроорганизмов и многоклеточных паразитов (Castillo, Yoshino, 2002). Взаимодействие рецепторов со специфически­ми лигандами приводит к активации циркулирующих клеток, их направленной миграции в место проникновения патогена и запуску процесса фагоцитоза. В результате происходит уничтожение , посредством кислород зависимых и кислород независимых механизмов. Если углевод-связываю- щие молекулы имеют сывороточную локализацию, то они могут повышать эффективность фагоци­тоза, выполняя функции опсонинов.

В рамках исследования взаимоотношений паразит-хозяин на примере модели Biomphalaria

glabrata - трематода Schistosoma mansoni было показано, что ключевое начение в распознавании гемоцитами моллюска спороцист S. mansoni играют именно белок-углеводные взаимодействия (Boswell, Bayne, 1986). При этом данные молекулы могут иметь как клеточную, так и сывороточ­ную локализацию. Растворимые лектины гемолимфы, сходные по своей углеводной специфичности с ConA, ECA, SBA, TPA и WGA, были обнаружены в гемолимфе моллюска B. glabrata (Johnston, Yoshino, 1996). При этом полученные лектины обладали способностью связываться с гликопротеи­нами и гликолипидами, выделенными с поверхности тегумента спороцист S. mansoni. Следует от­метить, что система B. glabrata - S. mansoni является крайне сложной для проведения сравнитель­но-иммунологических исследований., Весьма перспективными для выполнения такого рода работ служат системы моллюски-трематоды, в которых моллюск играет роль второго промежуточного хозяина. К таким системам относится выбранная нами модель двустворчатые моллюски Mytilus edulis - метацеркарии Himasthla elongata, некоторые результаты изучения которой приведены в на­стоящем сообщении.

Материалы и методы

Объектом исследования стали мидии Mytilus edulis, собранные в июле 2008 г. районе Бело­морской Биологической Станции «Картеш» им. О.А. Скарлато Зоологического института РАН. В экспериментах было использовано более 60 животных возраста 4-6 лет. Гемолимфу с клетками по­лучали в туберкулиновый шприц из заднего аддуктора моллюска и консервировали 5% (по объему) 0,3 М раствора ЭДТА на фильтрованной морской воде (ФМВ). Клетки отделяли от гемолимфы цен­трифугированием (7 мин при 200g) и отмывали от ЭДТА модифицированным раствором Дальбекко без Ca²⁺ и Mg²⁺, содержавшим 25 г/л NaCl. При исследовании гуморальных факторов раствор ЭДТА к образцам гемолимфы не добавляли, центрифугирование проводили при аналогичных условиях.

Для изучения гемолитической активности безклеточной гемолимфы и циркулирующих кле­ток M.

Титры гемагглютининов оценивали в реакции гемагглютинации (РГА) по общепринятой ме­тодике. РГА осуществляли в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических реак­ций («Медполимер», Санкт-Петербург), заполняя лунки 50 мкл ФР. Серийные двукратные разведе­ния исследуемых образцов гемолимфы готовили 8-канальной цифровой пипеткой («Ленпипет», Санкт-Петербург), перенося из лунки в лунку по 50 мкл серийных разведений индивидуальных об­разцов гемолимфы. Рабочую 1% суспензию ЭЧ добавляли в лунки по 25 мкл.

Для изучения гемолитической активности циркулирующих клеток Mytilus edulis был исполь­зован метод, являющийся безгелевой модификацией реакции локального гемолиза по Н.К. Ерне. Ге­моциты переводили в полную культуральную среду на основе RPMI-1640 с содержанием 24 г/л NaCl, 10 мМ HEPES, 2% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глютамина и 100 мкг/мл пе­нициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (все реактивы - «ПанЭко», Россия), устанавливая концен­трацию гемоцитов равной 60 тыс. клеток в 1 мл среды. Клеточную суспензию вносили в 96-луноч- ный планшет (Sarstedt) по 200 мкл, и добавляли 25 мкл 4%-ной суспензии интактных, предобрабо­танных лектинами или десиализированных ЭЧ. После 3 ч инкубации при 10°С образцы центрифу­гировали (10 мин при 200g), и в надосадках оценивали выход гемоглобина из ЭЧ по оптической плотности (ОП, λ=405 нм) на многоканальном спектрофотометре ПИКОН (Москва). Параллельно исследовалась способность гемоцитов, предобработанных лектинами, к лизису нативных ЭЧ. Для этого в культуры клеток вносили растворы лектинов в субагглютинирующих концентрациях, полу­ченных в предыдущих работах, инкубировали 60 мин. при температуре соответствующей темпера­туре морской воды в это время года, после чего добавляли 25 мкл 4%-ной суспензии клеток-мише­ней. Для десиализации ЭЧ использовали 1% раствор трипсина на физиологическом растворе, кото­рый перед использованием был подогрет до 37° С, pH стабилизировали путем добавления 100 мкл 1М HEPES.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакетов про­грамм Exce1 и STATISTICA 5.0. Итоговые результаты экспериментов выражали в форме средней арифметической и ее ошибки. Для определения статистически значимых различий между независи­мыми группами нормально распределённых данных использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Применение лектинов для решения основных проблем фундаментальной и сравнительной им­мунологии, вирусологии и клеточной биологии является одним из перспективных методологиче­ских подходов. Лектины тесно связаны с исследованием структуры и функций клеточных мембран, что находит широкое применение в рамках исследования защитных реакций различных представи­телей беспозвоночных. В ходе серии собственных экспериментов была предпринята попытка оце­нить влияния лектинов с различной углеводной специфичностью на функциональную активность как циркулирующих клеток, так и белков гемолимфы на примере гемагглютининов и гемолизинов (см. таблица).

В литературе описано несколько способов взаимодействия лектинов и гемоцитов моллюсков (Fryer et a1., 1996). Во-первых, это непосредственное связывание углевод-распознающих структур гемоцитов с лигандами на поверхности патогена. Во-вторых, лектины, входящие или искусственно введенные в состав покровов модельных частиц (например, ЭЧ), взаимодействуют со специфиче­скими углеводными структурами на поверхности гемоцитов, результатом чего является активация клеток. И, наконец, растворимые лектины гемолимфы могут полимеризоваться с образованием сложных комплексов, тем самым, вызывая агглютинацию эритроцитов. В рамках собственных экс­периментов второй подход был реализован для исследования клеточных реакций врожденного им­мунитета, а третий подход - для изучения гуморальных факторов гемолимфы M. edulis.

При исследовании цитолитической активности гемоцитов мидии M. edulis было установлено, что лектины, обладающие способность специфически связываться с терминальными углеводами NAcG1c (лектины картофеля и завязей пшеницы) и NAcGa1 (лектины сои, бузины черной и улитки), повышают эффективность распознавания гемоцитами эритроцитов человека (см.

Данные литературы также свидетельствуют о ведущей роли углевод-распознающих рецепто­ров циркулирующих клеток моллюсков в процессах распознавания и элиминации патогена. Было показано, что, помимо влияния на цитотоксическую активность гемоцитов, лектины растительного и животного происхождения способны изменять кислородный метаболизм клеток (Hahn et al., 2000). Продукция активных форм кислорода достигала максимума при использовании в качестве стимулятора конъюгата БСА-Gal, что указывает на важную роль в реакциях распознавания молекул галактозы в терминальном положении. Еще одним примером подобных взаимодействий может слу­жить участие лектинов, играющих роль опсонинов при взаимодействии с чужеродными субстрата­ми при фагоцитозе у различных представителей двустворчатых моллюсков (Tripp, 1992). Кроме то­го, использование лектинов, специфичных к NAcGlc и NAcGal, в качестве индукторов пролифера­ции приводило к достоверному увеличению уровня включения BrdU в гемоциты M. edulis (Pipe et al., 1997).

При постановке «обратного» эксперимента, т.е. при обработке гемоцитов лектинами, досто­верное увеличение гемолитической активности клеток было зарегистрировано при использовании лектинов картофеля и сои, когда уровень гемолиза достиг 0.,214±0.,024 и 0.,242±0.,022 ед.ОП, соот­ветственно. Полученные результаты однозначно указывают на то, что данные лектины способны непосредственно взаимодействовать с поверхность гемоцитов, вызывая активацию клеток. Исполь­зование остальных лектинов не приводило к изменению гемолитической активности клеток. Можно предполагать, что некоторые лектины способны экранировать определенные рецепторы на клетках мидии, тем самым, снижая эффективность распознавания клеток-мишеней, что приводит к сниже­нию уровня лизиса эритроцитов. Этот факт подтверждают данные литературы, указывающие на то, что лектины с различной углеводной специфичностью способны к избирательному связыванию с клетками моллюсков Mytilus edulis, Cerastoderma edule и Ensis siliqua (Wootton et al., 2003). Так, КонА взаимодействует с большинством циркулирующих клеток моллюсков вышеперечисленных видов моллюсков, тогда как лектины завязей пшеницы и арахиса связываются менее чем с полови­ной гемоцитов. Результаты эксперимента с десиализированными эритроцитами показали, что уда­ление гликокаликса с поверхности клеток приводит к снижению уровня гемолитической активно­сти, что еще раз указывает на углеводную природу распознаваемых гемоцитами молекул. Вместе с тем, использование лектина сои приводило почти к 3-кратному увеличению цитолитической актив­ности гемоцитов.

При исследовании углеводной специфичности гуморальных факторов гемолимфы мидии бы­ло показано, что титр гемагглютининов достоверно возрастал лишь в случае обработки эритроци­тов лектинами, специфичными к aDMan (конА и лектин гороха). Незначительные, в среднем на од­но двукратное разведение гемолимфы, увеличения титра гемолизинов были отмечены в случае об­работки эритроцитов лектинами завязей пшеницы и арахиса, также специфичными к NAcGlc и NAcGal, соответственно.

Таким образом, в ходе серии экспериментов было показано, что опсонизация эритроцитов млекопитающих лектинами, специфичными к NAcGlc (лектины картофеля и завязей пшеницы) или NAcGal (лектины сои, бузины черной, арахиса и улитки), приводила к усилению гемолитической активности гемоцитов M. edulis. Среди гуморальных факторов гемолимфы было зарегистрировано достоверное увеличение титров гемагглютининов при обработке эритроцитов лектинами, специ­фичными к маннозе. Таким образом, клеточные механизмы врожденного иммунитета играют клю­чевые роль в распознавании патогена, а наличие углеводных детерминант, специфичных к NAcGlc и NAcGal, значительно повышает эффективность этих реакций. Гуморальные факторы, по-видимо­му, выполняют вспомогательные функции.

Работа поддержана грантами РФФИ № 07-04-00095, 07-04-01675 и ИНТАС № 05-1000008-8056. Литература

Boswell C.A., Bayne C.J., 1986. Lectin-dependent cell-mediated cytotoxicity in an invertebrate model: Con A

does not act as a bridge // Immunology. V.57. P. 261-264.

Carballal M.J., Lopez C., Azevedo C., Villalba A., 1997. Enzymes involved in defense functions of hemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis // J. Invert. Path. V. 70. P. 96-105.

Castillo M.G., Yoshino T.P., 2002. Carbohydrate inhibition of Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cell

adhesion to primary sporocysts of Schistosoma mansoni // Parasitology. V. 125 (Pt 6). P. 513-525.

Fryer S.E., Bayne C.J., 1996. Phagocytosis of latex beads by Biomphalaria glabrata hemocytes is modulated in a strain-specific manner by adsorbed plasma components // Dev. Comp. Immunol. V. 20. P. 23-37.

Hahn U.K., Bender R.C., Bayne C.J., 2000. Production of reactive oxygen species by hemocytes of Biomphalaria glabrata: carbohydrate-specifc stimulation // Dev. Comp. Immunol. V. 24. P. 531-541.

Johnston L.A., Yoshino T.P., 1996. Analysis of lectin- and snail plasma-binding glycopeptides associated with the tegumental surface of the primary sporocysts of Schistosoma mansoni // Parasitology. V. 112. P. 469-479.

Pipe R.K., Farley S.R., Coles J.A., 1997. The separation and characterisation of haemocytes from the mussel Mytilus edulis // Cell Tissue Res. V. 289. P. 537-545.

Tripp M.R., 1992. Agglutinins in the hemolymph of the hard clam, Mercenaria mercenaria // J. Invert. Path. V. 59. P. 228-234.

Wootton E.C., Dyrynda E.A., Ratcliffe N.A., 2003. Bivalve immunity: comparisons between the marine mussel (Mytilus edulis), the edible cockle (Cerastoderma edule) and the razor-shell (Ensis siliqua) // Fish Shellfish Immunology. V. 15. P. 195-210.