ИССЛЕДОВАНИЕ Оборудование

1. Амплификатор.
2. Центрифуга настольная (скорость вращения - не менее 10000 об/мин).
3. Холодильники бытовые (на +2 - 8 °С и -20 °С).
4. Вытяжной шкаф.
5. Дистиллятор (стеклянный) и устройство для деионизации воды.
6. Источник питания постоянного тока.
7. Камеры для горизонтального и вертикального электрофореза.
8. Ламинар.
9. УФЛ-трансиллюминатор.
10. рН-метр.
11. Кварцевая лампа.
12. Вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания).
13. Автоклав.
14. Фотоаппарат, штатив для фотоаппарата, пленка типа "Микрат", фотореакгавы.
15. Сканирующее устройство.
16. Компьютер.
17. Микроскоп биологический.
18. Дозаторы с меняющимся объемом и наконечники к ним.
19. Пластиковые пробирки объемом 0,2 (0,5) и 1,5 мл.
20. Штативы для микропробирок.
21. Кюветы.
22. “Центрикон-100” (устройство для концентрирования и очистки ДНК).
23. Магнитная мешалка с подогревом.

Реагенты

1. Трис.
2. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
3. Соляная кислота (НС1).
4. Натрия гидроокись (NaOH).
5. Натрия хлорид (NaCl).
6. Додецилсульфат натрия (SDS).
7. Дитиотрейтол (DTT).
8. Протеиназа К.
9. Фенол.
10. Хлороформ.
11. 8-оксихинолин.
12. Спирт этиловый (ректификат).
13. Chelex.
14. ПЦР-буфер.
15. Смесь dNTP: dATP, dTTP, dCTP, dGTP.
16. Праймеры.
17. Taq-полимераза.
18. Агароза.
19. Борная кислота.
20. Бромфеноловый синий.
21. Бромистый этидий.
22. Маркеры величины фрагментов ДНК.
23. Акриламид.
24. Бисакриламид.
25. Глицерин.
26. ТЕМЕД.
27. Персульфат аммония.
28. Азотная кислота (HNO3).
29. Серебра нитрат (AgNOj).
30. Натрия карбонат (ЫазСОз).
31. Формалин.
32. Уксусная кислота.
33. Дистиллированная и деионизованная вода.

*1

Для исследования необходимо приготовить следующие растворы .

Растворы для выделения ДНК №1.5 А7 раствор NaCl (1 л).

Растворяют 292,2 г NaCl в 800 мл воды и доводят объем раствора до 1 л. Разливают на порции по 100 мл.

№ 2. 0,5 М раствор ЭДТА, pH 8,0 (1 л).

Растворяют 186,1 г двузамещенной соли ЭДТАх2Н2 О в 800 мл воды и доводят pH раствора до 8,0 с помощью едкого натра (динатриевая соль ЭДТА не растворяется до тех пор, пока pH раствора не будет 8,0), затем доводят объем раствора до 1 л. Хранят при комнатной температуре.

№ 3. 1 М раствор трис-НС1, pH 7,5 (1 л).

Растворяют 121,1 г триса в 800 мл воды, концентрированной соляной кислотой (приблизительно 65 мл) доводят pH до 7,5. Доводят объем раствора до 1 л. Хранят при комнатной температуре.

№ 4. 1 М раствор трис-НС1, pH 8,0 (1 л).

Растворяют 121,1 триса в 800 мл воды, концентрированной соляной кислотой (приблизительно 45 мл) доводят pH до 8,0. Доводят объем раствора до 1 л. Хранят при комнатной температуре.

№ 5. 20 %-ный раствор натрия додецилсульфата (SDS) (1 л).

Растворяют 200 г SDS в 800 мл воды при 60 °С и доводят объем раствора до 1 л. {Осторожно! Чрезвычайно летучі) Хранят при комнатной температуре.

№ 6. Лизирующий раствор: 10 тМ трис-НС!, pH 7,5; 10 тМ ЭДТА; 50 тМ NaCl; 2 % SDS (100 мл).

Смешивают 1 мл 1 М трис-НС1, pH 7,5; 2 мл 0,5 МЭДТА, pH 8,0; 1 мл 5 MNaCl; 10 мл 20 % SDS; добавляют 86 мл деионизированной воды. Хранят при комнатной температуре.

№ 7. 1 М раствор дитиотрейтола (DTT) (20 мл).

Растворяют 3,09 г DTT в воде, доводят объем до 20 мл. Разливают на порции по 1 - 5 мл и хранят при температуре -20 °С.

№ 8. Раствор протеиназы К, 10 мг/мл (10 мл).

Растворяют 100 мг сухой протеиназы К в 10 мл воды. Разливают на порции. Хранят при температуре -20 °С.

№ 9. Трис-ЭДТА-буфер (ТЕ), pH 8,0: 10 /»М трис-НС!, pH 8,0; 1 тМ ЭДТА, pH 8,0 (1

л).

Смешивают 10 мл 1 Мтрис-HCl, pH 8,0; 0,2 мл 0,5 М 3} (ГА, pH 8,0; 990 мл водія.

№ 10. Фенол, pH 8,0.

Фенол кристаллический расплавляют при 70 °С, перегоняют при 160 °С и добавляют 8-гидрооксихинолин до конечной концентрации 0,1 % (1 г на 1 л фенола). Это соединение является антиоксидантом; придает желтый цвет фенольной фракции. Полученное соединение насыщают 1 М раствором трис-НС1, pH 8,0, а затем 0,1 М раствором трис-НС1, pH 8,0. Насыщенный раствор фенола хранят при 4 °С под слоем 0,1 М раствора трис-НС1, pH 8,0. {Осторожно! Фенол является едкой жидкостью и вызывает тяжелые ожоги. Работая с ним, следует надевать предохранительные очки и перчатки. При попадании на кожу, его нужно смыть большим объемом воды с мылом.)

№11. Хлороформ/изоамиловый спирт (24:1).

Смешивают 240 мл хлороформа с 10 мл изоамилового спирта и хранят неограниченное время под слоем воды при комнатной температуре.

№ 12. 20 (5) %-ная взвесь ионообменной смолы Chelex (100 мл).

Помещают 20 г (5 г) Chelex в 80 мл воды, доводят объем до 100 мл. Chelex в воде не растворяется.