Исследования in vitro
В исследовании приняли участие 42 практически здоровых донора обоего пола (16 мужчин и 26 женщин). Средний возраст участников исследования составил 25,1±1,3 лет. Все доноры были осведомлены о целях исследования и подписали информированное согласие на участие в эксперименте.
Критерии включения в исследование:
- возраст от 18 до 55 лет;
- отсутствие клинических проявлений аллергических заболеваний на момент обследования и в анамнезе;
- данные клинического исследования: концентрация сывороточного IgE в пределах референтных значений для соответствующего возраста.
Критерии исключения из исследования:
- наличие хронических и острых воспалительных заболеваний, в том числе обострение инфекционных заболеваний, по данным анамнеза;
- наличие аутоиммунных заболеваний по данным анамнеза;
- состояние после оперативного лечения в течение 3-х месяцев;
- наличие тяжелой сопутствующей патологии со стороны сердечнососудистой, эндокринной, нервной систем;
- отсутствие информированного согласия на исследование.
У всех доноров определяли уровень сывороточного IgE. Требования к аллергологическому анамнезу обусловлены имеющимися данными о связи аденозиновой регуляции и аллергических заболеваний, в том числе измененному ответу на аденозиновую стимуляцию дендритных клеток от больных бронхиальной астмой [16].
Определение концентрации сывороточного IgE проводили методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов для количественного определения IgE (общий IgE) в сыворотке крови и амниотической жидкости человека («Вектор-Бест», Россия). Чувствительность набора составляет 2,5 МЕ/мл. Диапазон измерений: 0-750 МЕ/мл
Техника определения концентрации сывороточного IgE
В принципе работы набора «ИФА-общий IgE» заложен «сэндвич» - вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к IgE.
Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках при добавлении исследуемого образца и конъюгата «анти- IgE-пероксидаза» во время инкубации одновременно происходит иммобилизация общего IgE5 содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При аспирации содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата «анти-^Е-пероксидаза», не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации IgE. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству общего IgE в исследуемом образце. Во время инкубации с тетраметилбензидином происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связанного конъюгата «анти-^Е-пероксидаза». После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация общего IgE в исследуемых образцахПо результатам клинического обследования 12 из 42 доноров имели повышенные значения концентрации сывороточного IgE по сравнению с референтными, соответствующими их возрасту и полу. Это явилось причиной исключения данных доноров из дальнейших этапов исследования. Таким образом, после клинического обследования в in vitro исследование был включен материал 30 практически здоровых добровольцев.
2.1.2