1.1. МНОГОСТУПЕНЧАТОСТЬ ОПУХОЛЕВОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК IN VITRO И IN VIVO

В настоящее время в процессе канцерогенеза, пожалуй, наиболее правильно выделять три основных последовательных этапа: 1) трансформацию нормаль­ных клеток в опухолевые, наследственно передающуюся последующим попу­ляциям клеток; 2) размножение трансформированных клеток, приводящее к образованию опухоли (иногда этого не происходит, поскольку в некоторых случаях опухолевые клетки элиминируются из организма, прежде чем они сформируют опухолевый узел); 3) прогрессию возникшего новообразования, т.

Итак, неопластическая трансформация клеток — специфический* биоло­гический процесс, характеризующийся общими закономерностями: многос­тадийностью, необратимостью в целом и особенностями латентного периода. Этот процесс не включает в себя как процессы нормального развития, так и патологические изменения, подготавливающие клетку к вступлению в онко­генез. К нему не относятся также процессы, которые претерпевает сам кан­цероген при проникновении в клетки и выделении из нее при активации

¹ Специфичность обусловливается главным образом механизмом иммунологического распознавания рецепторами опухолевых клеток своих собственных эмбриональных, стадиоспецифических, дифференцировочных, поверхностных антигенов.

и др. Полный процесс опухолевой трансформации состоит из многих стадий, в том числе и первоначально обоснованных в 40-х годах стадии инициации и стадии промоции [Berenblum I., 1941; Friedwald W. F., Rous P., 1944]. Следу­ет отмстить, что эта упрощенная 2-этапная схема трансформации, вначале установленная на модели канцерогенеза кожного эпителия, в последующем была обнаружена во всех органах и тканях. Она наблюдается in vivo и in vitro на всех модельных системах: при взаимодействии с клеткой всех групп хими­ческих канцерогенов, опухолсродных вирусов, радиации, а также при плас­тмассовом канцерогенезе (Агеенко А. И., 1982, 1986; Эрснпрайс Я. Г., 1987; Remmer Н., 1983; Farber Е., 1984; Shubik Р., 1984; Kameron I. L., Thomas В. В., 1985]. Математическая модель многостадийного кацерогенеза у человека была обоснована в 1961 г. Р. Armitage и R. Doll. Вместе с тем, как сейчас стало известно, в процесс патогенетического превращения нормальной клетки в опухолевую включается много как генетических (онкогены, антионкогены), так и эпигенетических (ФР) факторов. Возможные механизмы их неопласти­ческого действия рассмотрены ниже. Сначала же остановимся на общих двух стадиях опухолевой трансформации (инициации и промоции) и онкогенах, которые вовлекаются в эти процессы, обеспечивая неопластическую тран­сформацию клеток.

Общепризнано, что опухолевая трансформация начинается стадией ини­циации, которая, как свидетельствуют многочисленные факты, адекватна процессу иммортализации клеток (первая стадия онкогенеза — - иммортализация хлеток, свойственна как доброкачественным, так и злока­чественным новообразованиям, см. ниже). На различных моделях химическо­го канцерогенеза показано, что инициатором может быть любой канцероген, тропный к определенному органу [см. Кобляков В. А., Турусов В. С., 1986]. Причем генотоксический канцероген^[II], взаимодействуя с геномом клетки, индицирует первую стадию — стадию инициации, что может приводить к частичной или полной трансформации.

рогены (оказывающие инициирующее и промоторное действие), могут также обладать канцерогенной активностью. Однако в отличие от полных канцеро­генов (образующих электрофильные метаболиты, которые ковалентно связы­ваются с ДНК, т. е. действующие на геном клетки) промоторы такой способ­ностью нс обладают и поэтому были названы эпигенетическими канцерогена­ми [Кобляков В. А., Турусов В. С., 1986].

Многочисленными работами установлено, что основная черта иницииро­ванных клеток заключается в их неспособности завершать процесс диффе­ренцировки. Показано также, что для опухолевой трансформации таких ини­циированных клеток (описаны случаи и спонтанной блокировки терминаль­ной дифференцировки, например, клеток эпидермиса у мышей некоторых линий) достаточно только воздействия какого-либо промотора.

Можно считать уже общепринятым разделение стадии инициации на две фазы: собственно инициация, в течение которой происходят макромолеку- лярные изменения клетки, и период закрепления эффекта инициации (не менее одного цикла деления клеток). .Таким образом, инициация является по крайней мере двухступенчатым процессом, включающим индукцию генети­ческих изменений в клетке (инициатор обычно «генотоксичен») и последую­щую пролиферацию. Стадия промоции также может быть разделена на две фазы, для которых предложены следующие термины: конверсия (обратимый процесс, требующийся для завершения синтеза ДНК) и манифестация, пред­ставляющая собой необратимую стадию промоции (SlagaT. J. et al. 1980; SlagaT. J., 1983; KumarS., 1988; Boreilo C. et al., 1989]. Установлено, что аппликация промотора, который, как правило, не обладает генотоксичсски- ми свойствами, должна быть повторной и достаточно длительной. Общепри­нято рассматривать фенотипические изменения клеток, вызываемые промо­торами, как «имитацию опухолевой трансформации». При этом наиболее характерным эффектом их действия считаются их влияние на клеточную дифференцировку (индукция дифференцировки или ее торможение) и инги­бирование межклеточных связей.

В экспериментах in vitro удается разделять способность промотора инду­цировать дифференцировку и промоторную активность, что прежде всего определяется типом и состоянием клеток. Показано, что одно и то же вещес­тво, действуя на имморталиэованные клетки, может индуцировать промотор- ный эффект, а на опухолевые — вызывать изменения только дифференци­ровки.

и различные травматические воздействия (например, скарификация кожи и др.). Правда, в этих случаях есть все основания предполагать, что механизм иромоторного действия всех травматических факторов сводится к активации генов, продукты которых обладают промоторным эффектом [Parkinson Е. К., 1985].

Считают, что критической стадией в неопластической трансформации является задержка нормальной дифференцировки с избыточной стимуляцией к делению. Некоторые исследователи в целом рассматривают злокачествен­ную опухоль, как болезнь дифференцировки, даже если ее развитие опреде­ляется случайными событиями, происходящими в геноме [Harris Н., 1990].

Важно отметить, что особенно четко можно проследить последовательные стадии опухолевой эволюции клеток, первично контактировавших с опухо­леродными вирусами, которые содержат онкогены, при исследовании тран­сформации in vitro. Эта система сама по себе уникальна, поскольку другие онкогенные агенты не могут быть генетически идентифицированы. В указан­ной же системе можно детально анализировать последовательные стадии неопластического превращения клеток через продукты онкогоенов до биоло­гического проявления трансформированного фенотипа.

Общим для опухолевых клеток, растущих in vitro и in vivo, является нарушение дифференцировки и регуляции размножения, т. е. утрата контро­ля за размножением и расположением. Причем молекулярные механизмы этих нарушений, как правило, в клетках разных типов различны на уровне генов, транскрипции их продуктов и трансляции, а также регуляции всех этих процессов.

Доброкачественные опухоли отличаются от злокачественных отсутствием способности к инвазии. Следовательно, рост и инвазия — это независящие одна от другой активности клеточной популяции. Однако провести четкую границу между этими двумя понятиями практически невозможно, поскольку существует непрерывная последовательность переходов от «нормального» усиления пролиферации до резко выраженных злокачественных типов ново­образований. В силу этого обстоятельства онкологи (морфологи, клиницис­ты) предложили следующие градации указанных процессов: гиперплазия,

метаплазия, атипическая метаплазия, дисплазия (I, II и III стадии), карцинома in situ, инвазивный рак и анапластический рак. Установилось четкое пред­ставление: опухоль (клинически, морфологически) не относится к злокачес­твенной, если отсутствует доказательство прогрессирующего деструктивного роста, т. е. инвазии. При этом необходимо обратить внимание на узловой критический момент указанных процессов. С каждой последующей града­цией все уменьшается вероятность возврата (реверсии) клеток и ткани к нормальному фенотипу. Считают, что дисплазия еще потенциально обрати­ма, кацинома in situ также еще может возвращаться к нормальной регуляции пролиферации, в то время как вероятность реверсии анапластического рака практически ничтожна. В свете обсуждаемой проблемы крайне важны иссле­дования генетической основы инвазивности клеток, которые, к сожалению, изучены явно недостаточно. Известно, например, что гены, ассоциированные с прогрессивным ростом опухоли и ее метастазированием, различны. Пред­полагают, что гены, вовлеченные в эти процессы, могут быть доминантными и рецессивными. Гены, кодирующие молекулу клеточной адгезии CD44 и фактор SF, являются доминантными, а гены, кодирующие nm23 и Е- кадгерин,— рецессивными [Birchmeier W. et al., 1991]. Обнаружено также, что отсутствие инвазии у исследованных опухолевых клеток связано с нали­чием адгезионной молекулы увоморулина на их поверхности [BrackeM. et al., 1989]. В результате воздействия соответствующими моноклональными антителами (МАТ) на молекулы увоморулина неинвазионные клетки приоб­ретали способность к инвазии.

Жизнеспособность опухолевых клеток, выходящих через межклеточные промежутки в циркуляцию (кровь, лимфа), обусловливается прежде всего их свойством образовывать агрегаты. Диспергированные опухолевые клетки (вне агрегатов) быстро погибают, и эффективность метастазирования резко сни­жается. Предполагают, что лишь 1 из 10 000 опухолевых клеток попадает в циркуляцию и даст вместе с другими гетерогенными клетками начало метас­татическому очагу [Averbach R., 1988].

Морфологически опухолевая инвазия весьма разнообразна, однако, как правило, она осуществляется прорастанием неопластических клеток по сосу­нам, железистым протокам и другим прилегающим тканям. Причем этот тканевый барьер преодолевается опухолью с разными темпами, зависящими от степени се злокачественности, т. е. создастся впечатление, что этот фено­мен является как бы результирующим выражением биологических свойств опухоли.

Предложено много объяснений инвазивного роста злокачественных ново­образований. Одно из первых основывается на происходящих в опухолевой клетке биохимических сдвигах, вследствие которых такие трансформирован­ные клетки более успешно конкурируют с клетками нормального фенотипа за питательный субстрат, например, за счет появления на их поверхности большого числа рецепторов для глюкозы, которую они быстро утилизируют Для построения собственных белков и нуклеиновых кислот («ловушка глюко­зы», «Ниагара глюкозы» — см. В. С. Шапот, 1975). В результате такого не­прерывного «насасывания» глюкозы опухолью как бы «в вакуум» в окружаю­щей се среде поддерживается неуловимо низкий уровень глюкозы, иногда в сотни и даже в тысячи раз меньший, чем в крови [Шапот В. С., 1975]. Мик- Роокружение опухоли изменяется (его pH) также и вследствие выделения продуктов интенсивного анаэробного гликолиза, происходящего в опухоли.

Клетки нормального фенотипа, не обладающие широкими возможностями адаптации своего метаболизма к создавшимся условиям, оказываются менее жизнеспособными по сравнению с клетками опухолевою фенотипа и погиба­ют. Вместе с тем феномен инвазивного роста опухолей совершенно невоз­можно объяснить только особенностями метаболизма ее клеток, поскольку бурный анаэробный гликолиз и интенсивное поглощение ими глюкозы не всегда коррелируют с их способностью прорастать в подлежащие нормаль­ные ткани.

Считают также, что повышение активности различных протеаз в опухоле­вых клетках, в том числе и ферментов, осуществляющих активацию плазми­ногена и плазминфермента, участвующих в процессе фибринолиза, можно рассматривать как систему фактора инвазивною роста и мстастазирования (Лягинский А. В., Егоров Б. Б., 1989; Durliat М., Burtin Р., 1989; Kwaan Н. С., КеегН. N.. 1990; Lala Р. k., Graham С. Н., 1990; Sloane В. F. et al, 1990; Burtin Р., DurliatM., 1991].

Установлено, что активная ферментативная фибринолитическая система животных и человека состоит из следующих компонентов: активаторов плаз­миногена (сериновые протеазы), плазминогена, ингибиторов активаторов плазминогена (АП) и ингибиторов плазмина. Активная сериновая протеаза плазмина образуется в результате избирательного підролиза, осуществляемо­го сериновой протеазой, единственной пептидной связи между Arg-560 и Val- 561 в молекуле плазминогена. АП представлены двумя тинами ферментов, различающимися по молекулярной массе, иммунологическим свойствам и механизму действия: АП тканевою типа (т-АП), основная функция которых состоит в предотвращении образования и удалении тромбов из кровеносного русла, и АП урокиназного типа (у-АП). Неопластическая трансформация клеток всегда сопровождается усиленным синтезом и секрецией у-АП, ассо­циированных со способностью опухолей к миграции и инвазии [Dano К. et al., 1985; Blasi F. et al., 1987; Layer G. T., Bumand K. G., 1990; Yu H., Schultz R. M., 1990; Meissaner A. et al., 1991 J.

Предполагают, что основная роль плазмина, генерированного у-АП, в том числе и других активных трипсиноподобных протеаз, сводится к отделению клеток от опухоли вследствие нарушения целостности десмосом, являющих­ся главным тином адгезионных контактов в экстрацеллюлярном пространст­ве. По мнению D. Т. Mullins и S. Т. Rohzcich (1983), генерация протеолиза мембран приводит к разрушению экстрацеллюлярного матрикса и обеспечи­вает миграцию опухолевых клеток. Неопластические клетки, способные к метастазированию, усиленно продуцируют проколлагеназу IV типа, перехо­дящую под действием плазмина в активную форму — коллагеназу IV типа. В свою очередь эти два фермента осуществляют разрушение компонентов ба­зальных мембран, тем самым обеспечивая мстастазированис |Levin Е. G. et al., 1984; Zeydcl М. et al., 1986; Burtin P. et al., 1990]. Утверждается, что инвазивность и способность к метастазированию прямо коррелируют с эк­спрессией гена коллагеназы типа IV и обратно — с эксперссисй гена нрокол- лагена IV (Ura Н. et al., 1989; Hendrix М. j. паї., 1990; Stctler-Stevenson W. G., 1990]. Показана экспрессия интегринов аїрі, абрі и рЗ только метастазиру- ющими клетками [Hens М. D., Ogle R. С., 1991; Rougon G. et al., 1992]. В нсметастазирующих клетках выявлен более высокий уровень экспрессии a5pi. Таким образом, экспрессия двух рецепторов коллагена IV типа и ламинина,

аїрі и абрі, так же как рз, однозначно ассоциирована с метастатическим потенциалом.

Обнаружено, что при некоторых бластоматозных процессах (например, при раках молочной железы) сериновые протеазы, включая плазмин, эласта- зу, тромбин и трипсин, после активации атакуют некоторые структурные гликонротеиды и эластин (Clavel С., Birembaut Р., 1988; Keilly D. et al, 1989; Starkey J. R., 1990; Caenazzo C. et al., 1990]. Система протеаз плазмина боль­ше вовлекается в стромальную инвазию, чем в разрушение базальной мембра­ны. При этом гормональные факторы не влияют на активность АП. Действие этих протеаз ограничивается специфическими антипротеазами. Активация эластазы связана с увеличением количества эластина в строме. Взаимодейст­вие опухолевых клеток с фиброзным эластином играет важную роль в их метастазировании в органах с высоким содержанием эластина [Тітйг J. et al., 1990]. Вторая группа, как считают цитируемые авторы, состоит из цистеино­вых протеаз, причем катепсин В, имеющий лизосомное происхождение, пред­ставляет главную активную систему. Инвазивная территория оггухолей содер­жит катепсин В, который участвует в деградации коллагена и активации коллагеназы IV типа. Металлоггротеазы совместно с этой коллагеназой обра­зуют наиболее важную, ключевую ггротеиназную систему, осуществляющую деградацию экстрацеллюлярного матрикса, обусловливая инвазивность и ме- тастазирование оггухолсвых клеток.

Помимо сказанного, повышение продукции коллагеназы опухолевыми клетками имеет непосредственное отношение к механизмам инфильтратив­ною роста и метастазирования еще' и потому, что коллагеназа, как известно, разрушает коллаген — основное вещество соединительной ткани. Например, М. Nakajima и соавт. (1987) для оценки коллагенолитической активности клеток опухоли в качестве субстрата использовали меченый |³Н]-пролином очищенный коллаген IV тигга и обнаружили четкую корреляцию между кол­лагенолитической активностью и метастатическим потенциалом оггухолсвых клеток. Клетки новообразований с высоким метастатическим потенциалом секретировали большее количество ферментов в активной и латентной фор­мах по сравнению с клетками опухолей с низким метастатическим потенци­алом. Инкубация коллагена IV типа со средой, кондиционированной клетка­ми с высоким метастатическим потенциалом, в присутствии трипсина приво­дила к высвобождению фрагментов этою коллагена. Однако «узким местом» таких оценок является невозможность объяснить избирательный характер действия протеаз или других токсических веществ, продуцируемых опухолью, на клетки нормальною фенотипа и «устойчивость» к ним самих опухолевых клеток. Следует заметить, что усиленное размножение трансформированных клеток ггс объясняет их «устойчивость» (предполагают, что погибают клетки пограничною слоя опухоли, а следующие вслед за ними прорастают) к воз­действию обсуждаемых факторов.

Показано, что плазмин, связанный с поверхностью неопластических кле­ток, обладая протеолитической активностью, может изменять их поверхность, стимулировать деление и способствовать их инвазивному росту (Blasi F. et al., 1986; Lipkalns V. A. et al., 1990].

Анализ изменения синтеза катепсинов В, L и D в различных злокачес­твенных новообразованиях и неопластически трансформированных клетках Указывает, что эти лизосомные протеазы играют значительную роль в инвазии * метастазировании опухолей (Rochefort Н. et al., 1990, 1991; Mumane М. et

al., 1991). Изменение уровня этих ферментов связано со сверхэксирессией генов липосомных протеаз, увеличением их секреции, которая регулируется гормонами и митогенными факторами. Показано, как в клетках опухолей неактивный предшественник катепсика D с молекулярной массой 52 000 последовательно конвертируется в активную форму посредством протеолити­ческого процессинга.

Некоторые ангиогенные факторы, как было продемонстрировано в много­численных работах, секретируемые трансформированными клетками, анало­гично опухолевым промоторам индуцируют синтез у-АП и коллагеназы IV типа, которые обусловливают пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток из капилляров. Этот процесс приводит к врастанию сети капилляров в опухоль в направлении источника антиогенного фактора [Thompson D. К. et al., 1983; Maxwell М. et al., 1991).

Опухолевый рост, как установленно, зависит от ангиогенеза и ангиогенез прямо или опосредованно индуцируется опухолями. Следовательно, индук­ция ангиогенеза служит важной стадией в канцерогенезе и развитии метаста­зов. Идентифицировано множество ангиогенных факторов, большинство из которых являются митогенами для эндотелиальных клеток и лишь некоторые отвечают за формирование сосуда. Индивидуальный ангиогенный фактор способен полностью индуцировать фенотип, присущий эндотелиальным клет­кам, которые образуют новые капиляры и микрососуды: подвижность, интен­сивная пролиферация и выделение протеаз, свойственные клеткам инвазиру- ющих опухолей [Presta М., Rifkin D. В., 1988]. Действие ангиогенного факто­ра опосредуется специфическими рецепторами и реализуется по механизму, включающему протеинкиназу С.

Активация плюрипотентного ангиогенного фактора (щелочной ФР фиб­робластов) осуществляется клеточной гепариназой, активность которой кор­релирует с величиной метастатического потенциала различных опухолевых клеток [Vlodavsky I. et al., 1990). АП, содержащиеся в экстрацеллюлярном матриксе и участвующие в регуляции клеточной инвазии и перестройке тка­ней, действуют синергично с гепариназой в последовательной деградации гепарансульфатпротеогликанов, блокирующих активность фактора. Гепарин, его фрагменты и кортикостероиды являются антиангиогенными факторами. Описаны два новых ингибитора ангиогенза — ингибитор, происходящий из хрящевой ткани, и тромбоцитарный фактор 4 [Tobelem G., 1990) Следует обратить внимание на двойственный характер отношений клеток эндотелия и опухоли, поскольку in vitro, как документировали L. Li и соавт. (1991), осуществляется непосредственный лизис метатоксических опухолевых кле­ток активированными цитокинами, продуцированными клетками эндотелия сосудов мыши. Обнаруженно, что у-интерферон повышает активность эндо­телия, индуцируемую фактором некроза опухолей (ФИО) [Doukas J., PoberJ. S., 1990).

Считают, что в инвазивности опухолей важная роль принадлежит клеточ­ной адгезии и способности к миграции. Представлены данные, свидетель­ствующие о наличии адгезивных молекул (общих для разных опухолей) на поверхности опухолевых клеток [Antonia S. et al.,1989; Fridman R. et al.,l990[. Причем важно подчеркнуть, что менее зрелые опухоли более склонны к метастазированию и инвазитивному росту, т. е. существует прямая корреля­ция между состоянием межклеточных контактов и дифференцировкой опу­холей. Установлено, что молекулы межклеточной адгезии (ICAM-1) пред­

ставляют собой клеточный поверхностный гликопротеид, ассоциированный с прогрессивным развитием меланом человека. На ряде клеточных линий меланом человека в экспериментах in vitro показано, что повышенная эк- сперссия ICAM-1 на поверхности этих клеток сопровождается увеличением их прилипаемости к лейкоцитам периферической крови человека (Miller В. Е., Welch D. R., 1990]. Вероятно возникновение таких комплексов способствует гематогенному метастазированию опухолей в результате более легкой задер­жки в органах эмболов из неопластических клеток и лемфоцитов. Клетки меланомы, подвергнутые воздействи- а-ФНО или у-интерферона (цитокины, повышающие экспрессию ICAM-1), образуют значимо больше колоний в легких после внутривенного введения мышам nude. Очевидно, экспрессия ICAM-1 является одним из факторов метастазирования опухолевых клеток.

Тесты, использующие миграцию опухолевых клеток между двумя отделе­ниями камер, тесты, в которых определяют высвобождение метаболической метки, а также ультраструктурний анализ процесса инвазии in vivo и in vitro свидетельствуют в пользу того, что активная миірация клеток опухолей и лизис внеклеточного матрикса являются важнейшими составляющими этого процесса (Marcel М. М. et al., 1987]. Считают, что взаимоотношение опухо­левых клеток с элементами внеклеточного матрикса во многом определяет ход инвазии и мстастазирования, а также клеточной дифференцировки. Та­кие компоненты внеклеточного матрикса, как гликозаминогликаны и гли- .копротеиды, могут создавать вокруг опухолевых клеток мощный электричес­кий заряд и тем самым определять, какие молекулы будут достигать клеточ­ной поверхности (Martinez Н. А., 1988].

G. S. Jotti (1988) и F. Soares (1990) предлагают 3-ступенчатую схему инва­зии клеток опухоли: 1) прикрепление их к матриксу, опосредованное лами­нином, фибронектином и рецепторами плазматической мембраны клеток; 2) лизис матрикса, осуществляемый гидролитическими ферментами, секре­тируемыми опухолевыми клетками; 3) продвижение клеток опухоли в район матрикса, измененный под влиянием протеолиза. При этом особая роль отво­дится протеазам: коллаїеназе, АП, катепсину В, протеазе цистеина, гепари­назе и гиалуронидазе. Предполагают также, что важные функции при этом ■ выполняет ламининсвязывающий белок, эксперссия которого значительно возрастает в метастазирующих вариантах опухолей различного гистогенеза (Aznovoorian S. et al., 1990; Kllinman H. К. et al., 1990]. Иммунохимически Показано, что активно инвазирующие и метастазирующие клетки опухолей экспрессируют аномально высокую цитоплазматическую концентрацию ре­цепторов ламинина (Wewer U. М. et al., 1987]. Интенсивность иммунохими- ческого окрашивания рецептора ламинина обратно коррелирует со степенью ^дифференцировки опухоли. Цитоплазматическая локализация рсцетора ла­минина может означать как повышенный пул вновь синтезированного белка, так и его накопление вследствие интернализации после взаимодействия с лигандом.

Анализ результатов многочисленных работ позволяет сделать вывод, что в экспериментальных системах уровень c-Ha-ras-онкогена прямо коррелирует С метастатическим потенциалом кзеток, при этом пороговый уровень эк­спрессии, необходимый для трансформации, ниже, чем пороговый уровень, необходимый для метастазирования (Muschel R., Liotta L., 1988; Bonftl R. D. et al., 1989; Traversari C., Parmiani G., 1990; Mielsen L. L. et al., 1991]. Тран­сфекция гена c-Ha-ras в опухолевые (в том числе разные новообразования

человека), но не метастазирующис клетки делает их мстастазирующими, и эти клетки начинают продуцировать большие количества коллагеназы (V типа. Отмечена прямая корреляция между степенью злокачественности и инвазивности данных клеток и их способностью вырабатывать коллагеназу ГУ типа [Klein-Szanto A. I. et al., 1989). Формирование опухолевых метаста­зов, как было показано в экспериментах J. R. Starkey и D. L. Berglung (1990), оказалось сниженным у животных, которым трансплантировали клетки ново­образований с введенными в них угнетающими функцию онкобелка р21 ~ антителами. Отмечено также снижение инвазий матрикса и удлинение ла­тентного периода развития опухоли после трансплантации таких клеток в организм животных. В системе in vitro у клеток с угнетающими функцию р21^г“ антителами способность к прохождению через барьер из базальной мембраны снижалась на 48% по сравнению с клетками, в которые были введены антитела, не угнетающие функцию р21~. В то же время исследова­ние экспрессии генов c-Ha-ras в опухолях человека и при канцерогенезе in vivo показало, что эта экспрессия не всегда достаточна для индукции метас­тазирования (Collard J. G. et al., 1988).

Трансфекция других различных онкогенов, таких как sre, myc, mos, raf, fes, fms, sis, erbB2, EA1 и p53, позволила выявить их участие в превращении некоторых трансформированных клеток в метастазирующис (иногда более эффективно, чем участие онкогена ras), хотя механизм этого процесса пока неясен (Egan S. Е. et al., 1987; Wright J. A. et al., 1990]. Предполагают, что перенос указанных онкогенов изменяет экспрессию биомолекул (например, металлопротеиназ и других протеолитических ферментов), ответственных за инвазию, аутокринных факторов, подвижности белков цитоскелета, рецепто­ров фибронектина, антигенов гистосовмсстимости (Н-2К, H-2D), обусловли­вающих в целом прогрессирование инвазии и метастазированис. Обнаружено также, что высокий уровень экспрессии и амплификация протоонкогена с- егЬВ2 в различных опухолях человека свидетельствуют о значительной опас­ности возникновения метастазов и высокой степени злокачественности этих новообразований (Toyoshima К., 1990). Амплификация и свсрхэкспрсссия протоонкогена her-2/neu в первичных злокачественных опухолях молочной железы человека связана с появлением ранних метастазов [Тіwan R. К. et al., 1992).

M. Phillips и соавт. (1990) изолировали ген pGM21, ассоциированный с высокой способностью к метастазированию аденокарцином молочных желез крыс. В период метастазирования отмечена усиленная экспрессия этого гона в клетках карциномы. Выделен также продукт гена mtsl (относится к семей­ству гонов, связывающих Са²* белков), характеризующийся специфической эспрсссией в клетках метастазов различных опухолей [Ebralidz A. et al., 1989].

Кроме онкогенов, способствующих инвазии и метастазированию, обнару­жены новые гены nm23 в клетках грызунов и человека, связанные наоборот с низким метастатическим потенциалом различных новообразований; отмече­на прямая корреляция между уровнями мРНК этих генов и способностью к метастазированию (Stahl J. A. et al., 1990; SteegP. S. et al., 1990]. Таким образом, очевидно, активация определенных онкогенов ведет в основном к экспрессии фенотипа, характерного для неконтролируемого опухолевого ро­ста. Он функционирует в качестве амплификатора экспрессии инвазивного и метастатического фенотипов.

Оказалось, что амплификация онкогена N-myc в нейробластомах чсловс-

ка связана с резко возрастающей метастатической способностью клеток этой опухоли. Последняя обусловлена N-myc-опосредованной супрессией промо­тора гена М НС-класса I {Lenardo М. et al., 1989].

Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о прямом учас­тии продуктов генов главного комплекса гистосовместимости (МНС), а именно H-2D- и Н-2К-антигенов класса I, в процессе роста и метастазирования злокачественных новообразований. Выявлена корреляция между развитием метастатического фенотипа и соотношением в экспрессии антигенов H-2D^b и Н-2К^Ь Показано, что эти антигены обусловливают метастатический потенци­ал разлиыных опухолей (Eisenbach L. et al., 1983; KatzavS. et al., 1984; Lopez N.M. et al., 1986; RuiterD. J. et al., 1986; Feldman M., Eisenbach L., 1987; Tanaka K. et al., 1988; Fidler I. J., Radinsky R., 1990].

Продемонстрирована отмена метастатического фенотипа на тест-систе­мах высокометастатических клонов некоторых опухолей, в частности карци­номы легкого Льюиса (3LL) и меланом В16 и BL6 после трансфекции Н-2К- локуса [De Giovanni С. et al., 1990; Eisenbach L. et al., 1990; Gorelik T. et al., 1990; Gattoni-Celli S. et al., 1990]. Трансфекция H-2K^b высокомстастатичсс- кого клона DI22 с сингенными Н-2К^ь-генами возвращала неметастатический фенотип, так же как и трансфекция с аллогенными генами (H-2K^d, H-2K^k, Н- 2К^Ь"¹). Возвращение к неметастатическому фенотипу было причинно связано с приобретением Н-2К-рестриктированной иммуногенности. Аналогичный подход использовался для тестирования влияния трансфекции клеток неме­тастатических клонов (Н-2К^и) с аллогенными Н-2К^Ьто,-генами или метаста­тических клонов с двумя генами Н-2К (Н-2К^Ь и H-2K^k, H-2K^d или При этом обнаружена корреляция между злокачественным потенциалом ис­следованных клонов опухолевых клеток и экспрессией на их поверхности антигенов гистосовмсстимости класса I. Идентичные результаты были полу­чены и при изучении роли экспрессии антигенов Н-2Ю и Н-2ІУ МНС класса

1 в метастазировании различных вариантов мышиной лимфомы BWT [Van den Driessche Т. et al., 1990]. Выявлено, что высокая метастатическая актив­ность клеток лимфом сопровождалась усилением экспрессии H-2D^k. Эк­спрессия других генов МНС класса II (Н-21А^к и Н-21Е^к, CD2, LFA-1, L3T4, Ly 2, Thyl) и онкогенов (fes, sre, fps, fms, erb, Ha-ras, Ki-ras, myc, myb) не коррелировала с злокачественностью лимфом. Предварительная трансфек­ция с клонированными сингенными Н-2Е>^к-іенами приводила к усилению метастазирования этих новообразований. Таким образом, модулированная Н-

2 экспрессия может контролировать степень злокачественности. Причем, очевидно, это связано не только с иммуномодулирующим эффектом, сколько с участием антиіенов МНС класса I в реакциях межклеточною взаимодейст­вия и клеточной адгезии.

Обнаружено усиления инвазивности и метастазирования под действием эпидермального ФР (Breillont F. et al., 1989]. Аналогичное действие оказывал ФР из тромбоцитов [Tsuruo Т. et al., 1989]. Показано, что (5-ТФР стимулирует продукцию ферментов деградации базальной мембраны (коллагеназы IV типа в 5 раз, гепариназы и у-АП в 2-4 раза) в опухолевых клетках, тем самым способствуя их инвазии и метастазированию [Nakajima М. et al., 1990]. В то же время другие ФР не влияли на процесс инвазии и метастазирования, а иные, например, р-ТФР, в некоторых клеточных линиях могли играть даже защитную роль [Pavelic К. et al., 1990]. Предполагают, что аутокринный ха­рактер реіуляции подвижности клеток может быть ключевым фактором на

начальных этапах миграции, тогда как специфические и неспецифичсские изменения внеклеточного матрикса способны в последующем облегчить дви­жение опухолевых клеток (Starkey J. R., 1990].

Можно привести еще множество различных предположений, объясняю­щих инвазивный рост. В частности, считают, что опухолевая клетка может действовать подобно лимфоциту-убийце, т. е. осуществлять «киллерный эф­фект» и т. д. Из сказанного видно, что феномен инвазивного роста опухоли является сосредоточием многих ее свойств, выраженных в разной степени в конкретных условиях роста трансформированных клеток. Например извест­но, что перевивка опухолевых клеток разных типов в различные участки ткани имеет не случайный, а определенный характер. Иногда трансплантиро­ванные клетки дают интенсивный инвазивный рост, перевивка же в другие участки приводит к замедлению их роста, нередко с формированием соеди­нительнотканной капсулы.

Исходя из вышеизложенного, к функциям трансформированных клеток, коррелирующим с таковыми инвазивного фенотипа, можно отнести подвиж­ность, потерю способности прилипать к альтернативному субстрату и гетеро- типичным клеткам, нарушение экстрацеллюлярного матрикса. Молекуляр­ными маркерами этого фенотипа, вероятно, могут быть, как уже отмечалось, молекулы межклеточной адгезии, клеточные поверхностные рецепторы и регуляторы гидралазной активности. Например, М. М. Mareel и соавт.(1990) предполагают наличие двух противоположно направленных генотипически детерминированных, чувствительных к регуляции путей реализации инвазив­ного фенотипа: Г и Г. От баланса между ними зависит, по-видимому, резуль­тирующий инвазивный фенотип. Очевидно, описанные факты имеют отно­шение и к феномену метастазирования.

Вообще необходимо обратить внимание на то, что метастазирова- ние — высокосслсктинныи процесс, регулируемый многочисленными факто­рами, являющимися биологическими характеристиками как опухолевых кле­ток, так и самого организма. Предполагается, что развитие метастазов связа­но с экспансией предсуществующих метастатических клеток среди гетеро­генных популяций опухолевых клеток. Метастазы могут иметь клональное происхождение, и различные метастазы моїут образовываться вследствие миірации одной клетки. Развитие метастазов зависит от взаимодействия ме­тастазирующих клеток с микроокружением различных органов. В экспери­менте продемонстрировано предпочтительное возникновение органоспеци­фических метастазов, т. е. иными словами, органоспецифические условия способствуют адгезии злокачественных клеток к определенным гистологи­ческим структурам (Pauli В. U. et а!., 1990; Zetter В. R., 1990; Fidler I. J., 1991 ]. Существенную роль в этом процессе играют фибронсктин, ламинин, колла­ген IV и V типов, а также ряд ферментов, продуцируемых опухолевыми клетками и изменяющих свойства мембран (катепсин В, коллагеназа IV типа, эластаза, гепариназа и АП). При этом биофизические и биохимические дан­ные показали, что преимущественная адгезия опухолевых клеток к сосудис­тому эндотелию может быть опосредована количественными различиями в экспрессии химически идентичных молекул адгезии на поверхности эндоте­лия разной тканевой принадлежности. После адгезии опухолевых клеток происходит метаболическое соединение между прикрепляющейся парой кле­ток и инициация экстравазации (выхода жидкости из кровеносных или лим­фатических сосудов в ткани). Отмечается, что существенное значение в про-

2В

цесеах инвазии и метастазировании имеют рецепторы адгезии и рецепторы клеточного матрикса (иптегрины и др.) Дифференциальная экспрессия этих рецепторов (в частности, коллагена IV типа и ламинина) так же, как увели­ченная скорость процессинга, объясняют усиленную способность метастати­ческих клеток взаимодействовать с базальной мембраной и способствовать формированию метастаза.

Кроме этого, необходимо учитывать, что метастазы в различных органах развиваются из различных клеток-предшественников (гетерогенность субпо­пуляций клеток опухоли). Это, естественно, приводит к отличиям их свойств и ответа на терапию.

В опухолевые могут трансформироваться разные типы клеток дифферен­цированных тканей и недифференцированные клетки (стоволовые). Причем в трансформированных стволовых клетках обычно протекают измененные процессы дифференцировки. В большинстве случаев трансформированные клетки сохраняют некоторые свойства исходной нормальной ткани, что дает основания для идентификации и классификации этих неопластически тран­сформированных клеток.

Основные свойства, отличающие трансформированные клетки от роди­тельских нормальных клеток, следующие.

29

Перечисленные особенности нс являются для трансформированных кле­ток уникальными и абсолютными, поскольку в той или иной мерс они прису­щи инфицированным опухолеродным и вирусами клеткам, а также нормаль­ным длительно пассируемым в культурах тканей или быстрорастущим деля­щимся клеткам.

Иными словами, все опухолеспсцифическис признаки имеют нс качес­твенный (пока не выявлено ни одного такого признака), а количественный характер, причем это заключение справедливо как для феномена опухолсоб- разования в целом, так и его отдельных фундаментальных свойств, таких как темпы роста, злокачественность и др. Вместе с тем в совокупности вес пере­численные выше свойства и главным образом такие, как многослойный, трехмерный рост, являющийся основным отличием злокачественно трансфор­мированных клеток от их нормальных прототипов в однослойных культурах на стекле, способность к росту в агаровой среде и другие, особенно при сопоставлении клонированных популяций в одинаковых условиях с кон­трольными культурами, являются надежными критериями неопластической трансформации клеток in vitro.

Существенно, что потребность в сывороточных ФР у таких трансформи­рованных клеток резко снижена или же их пролиферативная активность вообще нс зависит от этих факторов. Опухолевые клетки начинают либо сами продуцировать и выделять в окружающую среду стимулирующие рост факторы, либо усиленно экспрессируют рецепторы к ним, что указывает на аутокринный тип контроля их размножения (т. с. когда регуляторные факто­ры взаимодействуют с теми же клетками, которые их продуцируют). Причем различные эффекты этого взаимодействия определяются количеством и со­ставом рецепторов на клеточной поверхности. Обычно в выпотах при злока­чественных опухолях любой природы и гистогенеза (в том числе и новообра­зований человека) определяется множество трансформирующих ФР, напри мер, таких как а- и р-ТФР, ФР фибробластов, эпидермиса, колониестимули­рующие факторы, интерлейкин 3, факторы, способные вызывать субстратнс- зависимос размножение клеток и др. |Pebusque М. J. et al., 19ХХ; Nakamoto Т. et al., 19XX; Roussel M. F. et al., 19XX; Seo M. K. et al., 19XX; Wong D. T. et al., 1988; Yong D. C. et al., 19XX; Steel S. M., 19X9; Perisio P. M., Brooks J. J., 19X9]. Следует обратить внимание на разнонаправлсннс действия ФР. Так, р-ТФР может служить аутокринным ишибирующим фактором при некоторых зло-

31

качественных новообразованиях, втом числе злокачественных опухолях пред­стательной железы человека [Wilding G. et al., 1989]. В то же время продуци­рование этого ФР клетками опухоли предстательной железы мржет выпол­нять также важную паракринную функцию при развитии опухолевой стромы и метастазов. Отмечена роль аутокринного механизма роста в поддержании недифференцированного состояния лейкозных клеток [Heil М. F. et al., 1989J. Обнаружены различия в чувствительности подтипов (различно дифференци­рованных) клеточных линий карциномы толстой кишки человека к эффек­там ингибирования роста под действием ТФР pi и [32 [Hoosein N. М. et al., 1989J. Определена корреляция между уровнем дифференцировки и чувстви­тельностью к антипролиферативному действию этих ФР.

В отличие от опухолевых клетки нормального фенотипа требуют для осуществления всех этапов пререпликативного периода присутствия в кле­точном окружении нескольких (различных) ФР, как минимум двух типов: обусловливающих компетентность клеток (факторы компетентности) и фак­торы прогрессии (в отношении синтеза ДНК), т. е. непосредственно стимули­рующих пролиферативную активность. При этом очень важно подчеркнуть, что один и тот же ФР может стимулировать как приобретение клетками компетентности, так и последующие этапы пререпликативного периода [Агеенко А. И., 1986; Епифанова О. И. и др., 1988; Oliff A. et fl., 1985; Kaczmarek L. et al., 1985; Son-entinoV. et al., 1986; Forgue-Lafitte M. et al., 1989; Lang R. A., Burgess A. W., 1990; Wada T. et al., 1990; Ethier S. P. et al., 1991[.

Особое внимание следует обратить на генетическую нестабильность. Это широкое понятие включает в себя процессы нестабильности ДНК, хромосом и іенома, которые осуществляются прежде всего за счет потери отдельных хромосом (изменения их числа), или структурных пересгроек хромосом. По­казано, что первичная структура хроматина играет важную роль в модуля­ции повреждений макромолекул хромосом, одноцепочечных разрывов ДНК и в механизмах репарации на ранних этапах канцерогенеза. Генетическая нестабильность присуща клеткам, как первично возникшим, так и прогрес­сирующих злокачественных новообразований. Наиболее общее объяснение этого феномена основывается на происходящем снижении активности фер­ментных систем (эксцизионная репарация) в неопластически трансформиро­ванных клетках. Это происходит, как считают, вследствие повышения или общей мутабельности (транслокации, делеции и т. д.), приводящей к инакти­вации гонов, которые содействуют репарации ДНК, или активности мутазы [Веленчик М. М., 1970, 1976; Knudson A. G., 1984; Neubert D., 1984; Champeux S., 1989; Shackney S. E. et al., 1989; Teyssier J. T., 1989; Neiman P. E., Hartwell L. H., 1991; Boffa L. C. et al., 1992].

Таким образом, гипермутации, очевидно, являются основой генетической нестабильности. «Нормальная» спонтанная частота мутаций около IO^-10 мута- ций/(нуклеотид-Х-клеточная генерация).

Клетки больных пигментной ксеродермой демонстрируют связь между нарушением репарации ДНК и возникновением опухолей. Комплементаци- онный анализ этих клеток различных линий, а также дефектных по репара­ции клеток ірьізунов показал, что от 9 до 13 генов и более вовлечены в ранние этапы эсцизиоиной репарации ДНК [Bootsma D. et al., 1988J. Ген эксцизион-

ной репарации человека ERCC-1 клонирован и охарактеризован на молеку­лярном уровне. Выянилось, что он гомологичен генам репарации дрожжей Е. coli. Следовательно, системы репарации эволюционно консервативны

Известно, что системы репарации ДНК способны эффективно удалять большинство повреждений ДНК, например мстилтрансфераза способствует репарации (Лметилгуанина. В то же время обнаружены антирепарационные последовательности ДНК, которые вследствие структурных и кон форм ани­онных влияний препятствуют репарации поврежденных оснований ДНК, спо­собствуя их персистенции и в последующем трансформации поврежденных клеток. Продемонстрировано, что различные канцерогены атакуют опреде­ленные последовательности в ДНК. Например, М-метил-Ы-нитрозомочевина вызывает мутацию в 12-м кодоне протеонкогена c-Ha-ras при канцерогенезе молочной железы крысы, а 1Ч-гидрокси-2-ацетиламинофлюорен вызывает мутацию в 61-м кодоне этого же онкогена при канцерогенезе печени мыши [Topal М. D., 1988]. Вместе с тем в целом в цитируемой работе нет достаточ­ных данных для вывода о том, что активация онкогенов возникает вследствие индуцированных мутаций в определенной последовательности ДНК.

Важно заметить, что обнаружен Т-клеточный фактор, который практичес­ки полностью тормозит репарацию ДНК, т. е. иначе говоря, иммунные эф­фекторные клетки могут способствовать инициации и прогрессии опухолей {Marquardt Р. et al., 1990].

Предполагают, что генетическая нестабильность может быть одним из главных «движущих» источников опухолевой прогрессии, а роль хромосом­ных изменений является по меньшей мере «позволяющей», создающей усло­вия для индивидуального развития опухоли. Определена также роль в опухо­левой прогрессии клональной эволюции (клоногенные клетки) и равновесия между генетической нестабильностью и селекцией [Kendal W.S., Frost Р., 1987; Heim S. et al., 1988; Barrett J. et al., 1989]. Выявлены точности разделе­ния хромосом при нормальном клеточном цикле и канцерогенезе. Для под­держания нормального распределения хромосом между клетками необходи­мо присутствие равного числа специфических генов. Изменение дозы генов в результате неправильного расхождения или поломок хромосом может стать началом цепной реакции общей потери точности разделения хромосом при митозе {Holliday R., 1989].

Считают, что клональная эволюция, которая характеризует злокачествен­ные опухоли, является следствием двух антагонистических сил, действующих на популяцию опухолевых клеток: дивергенции и конвергенции [Niwa О. et al., 1989]. Основные причины генетической нестабильности, связанные с первой силой, следующие: ошибки в синтезе ДНК, сверхрепликация, ано­мальная репарация ДНК, высокая скорость рекомбинации, вызванная эк­спрессией хрупких сайтов и, возможно, экспрессией ретротранспозонов, час­тые невоссоединения хромосом как следствие дисбаланса дозы гена, ано­мальное метилирование ДНК. Вторая сила заставляет популяцию опухолевых клеток сближаться с гетерогенными фенотипами через отбор посредством выработки механизмов защиты от хозяина, конкуренцию за питательные вещества и О₂ среди клеток опухоли, клеточные взаимоотношения между опухолью и окружающими нормальными тканями.

Таким образом, опухоль представляет собой сово^пчостъ генетически и фенотипически отличающихся гетерогенных клонов, являющихся источни­ком опухолевой прогрессии. Причем, согласно высокоаргумечтированным

положениям L. Foulds, прогрессия опухоли происходит при постоянном уровне нестабильности генома и имеет четко выраженный вектор, характеризую­щийся снижением доли клонов клеток нормального фенотипа и постоянным увеличением доли клонов клеток с «злокачественным» .фенотипом. Эго со­провождается повышением степени автономности опухолевого роста, т. е. уменьшением чувствительности трансформированных клеток к рострсгули- рующим воздействиям экзогенных и эндогенных внутриклеточных факторов коїггроля их размножения на организменном, органном, тканевом и внутрик­леточном уровнях. При этом изменяется степень экспрессии генов, участвую­щих в регуляции пролиферативных процессов. В большинстве случаев тран­сформированные клетки начинают самостоятельно продуцировать ФР (ауток- ринный тип реіуляции), что в совокупности приводит к нерегулируемому их размножению. Наряду с повышением степени автономности роста опухоле­вых клеток возрастает и степень их злокачественности. Следовательно, про­цесс развития опухоли представляет собой селекцию определенных клонов на фенотипическом уровне. Нельзя исключить также, что опухоль сама со­здает условия микроокружения, способствующие ее прогрессии.

Вместе с тем следует подчеркнуть, что, несмотря на постоянный мутаци­онный пресс, популяция опухолевых клеток сохраняет все элементы нор­мальною генотипа. Это, с одной стороны, свидетельствует о стабилизирую­щем отборе, происходящем в опухоли, а с другой — указывает на возмож­ность снижения злокачественности трансформированных клеток на любой стадии опухолевой прогрессии. - ■ '

Как уже отмечалось, проявлением генетической нестабильности нсоплас- тически трансформированных клеток являются различные генетические на­рушения (точечные мутации, делении, инверсии, амплификации, транслока­ции и др.), приводящие к активации протоонкогенов, т. е. определенных кле­точных генов, непосредственно участвующих в опухолевой трансформации клеток (Агеенко А. И., 1986; Сейц И. Ф., Князев П. Г., 1986; Сейц И. Ф. 1990; Marks Р. A. et al., 1987; Manzo G., 1989}. В традиционном понимании они относятся к доминантным онкогенам, т. с. их активация означает структурно­функциональное или количественное изменение продукта, способствующее канцерогенезу. Выявлены и их антагонисты — антионкогены (рецес­сивные — супрессорные юны опухолевой трансформации). Мутация или ут­рата их продукта обусловливает снятие оіраничсния на опухолевый рост. В основном продукты этих генов осуществляют негативную регуляцию клеточ­ною деления. Показано, что они функционируют на транскрипционном и ностгранскринционном уровне и супрессируют действие онкогенов (Имянитов Е., Князев П. Г., 1992; Sager R., Craig R. W., 1985; Copeman M. C., 1987; Klein G., 1987; Sacks L., 1987).

Вместе с тем следует обратить внимание на то, что собственно ни один из активированных онкоіенов не является практически доминантным в класси­ческом понимании (терминология по Мецделю) и прежде всею хотя бы потому, что их продукты, весьма, вероятно, могут конкурировать за мишени со своими же протоонкогенами. Это, естественно, может блокировать их доминантную активность. С другой же стороны, активированный онкоген чаще всею контролируется сильным промотором и может быть амплифици- рован, а при трансфекции в клетку вводится обычно не одна, а несколько копий активированною онкогена. Далее при обсуждении этой проблемы необходимо подчеркнуть невозможность полного функциональною разгра-

ничения эффектов действия продуктов онкогенов и антионкогенов, посколь­ку для большинства из них неизвестны ни мишени, ни механизм действия и, кроме того, как установлено, например, в отношении генов пролиферативно­го ответа, одни и те же гены могут осуществлять функционально противопо­ложные эффекты, зависящие в том числе от видовой специфичности и типа клеток. Учитывая это, все же основным отличием онкогенов от антионкоге- нов следует считать фенотипический эффект, а именно онкоген должен обусловливать иммортализацию (неограниченный рост) и неопластическую трансформацию, а антионкогены, наоборот, ингибировать деление и вызы­вать реверсию.

Доказательства существования аигионкогенов были получены при иссле­дованиях «семейных» опухолей, опухолей у дрозофил, возникающих при рецессивных мутациях, на основании результатов экспериментов по гибриди­зации нормальных и опухолевых клеток, индукции конечной дифференци­ровки линий опухолевых клеток, фенотипической реверсии трансформантов in vitro, в результате открытия регуляторных последовательностей, располо­женных вблизи определенных онкогенов, при изучении подавления опухоле­вого роста продуктами нормальных клеток, а также при наблюдениях за возникновением ревертантов и потерей «рецессивных генов злокачествен­ности», наконец, при использовании наиболее многоэтапного и трудоемкого метода молекулярной биологии «прогулки по хромосоме» (обнаружение эк­зонов, локализованных в области консервативной делеции). Кроме того, по­теря аллелей на определенных хромосомах указывает на наличие супрессор­ных опухолевых генов, например, таких как р53 и Rbl. Методом гибридиза­ции ДНК из образцов 79 первичных карцином молочной железы человека Т. Sato и соавт. (1990) проведен частичный анализ потери аллелей и установ­лено, что существует по крайней мере 4 супрессорных гена на хромосомах 13q, 16q и 17q для данной опухоли.

Очевидно, все эти обнаруженные антионкогены представлены нескольки­ми классами, один из которых ответствен за регуляцию нормальной диффе­ренцировки, другой класс составляют гены, супрессирующие клеточное раз­множение, т. е. осуществляющие негативную регуляцию деления клеток (суп­рессорные гены, эмерогены, оітухолесупрсссирующис гены и др.). У крупных видов, характеризующихся большой продолжительностью индивидуальной жизни (как, например, человек), представители, чувствительные к бластома- тозным процессам, гетерозиготны по одному из этих генов, а возникновение опухолей связано с приобретением соматической мутации по тому же гену [Paul J., 1989). На примере гена ретинобластомы Rbl продемонстрировано, что выключение генного продукта, регулирующего цикл деления клеток, может происходить под влиянием точковых мутаций, транслокаций, микро- дслеций, потери хромосомных плеч (Ballhausen W. G., 1990).

Предполагают, что продукты некоторых онкогенов, в частности гена Е1А аденовирусов, участвуют в неопластической трансформации как ингибиторы транскрипции определенных клеточных генов, выполняющих функции суп­рессоров опухолей или антионкогенов.

Генетический анализ показал, что инактивация определенных генов весь­ма существенна для развития ретинобластомы (ген Rbl чувствительности к ретинобластоме локализован на хромосоме 13q14), опухоли Вильмса (хромо­сома 11р) и рак толстой и прямой кишок. Эти гены идентифицированы и клонированы, их нормальные функции связаны с контролем транскрипции и

межклеті s«bjx взаимодействий. Среди этих генов — антионкогены FAP (об­ласть 5q2l — q22), MEN2A (lOpl 1.2 — ql 1.2) ген, кодирующий белки с мо­лекулярной массой 3001 и 117 ООО, ген Е1А (Mitchell С. D., 1991J. Ген Rbl отсутствует или мутирован в случаях ретинобластомы, а ген р53, локализова­нный на хромосоме 17р13.1, делегирован или мутирован в 70—80% случаев рака толстой кишки (Levine A. J., 1990]. Полагают, что мутация одного или обоих аллелей этих генов нарушает отрицательную регуляцию роста. При введении гена Rbl с ретровирусным вектором в опухолевую клеточную тумо- рогенн) гэ линию наблюдали частичную или полную потерю этими клетками туморогснности. Установлено также, что ангиогенная активность является наиболее ранним фенотипическим проявлением, возникающим как резуль­тат потери функции супрессорного антионкогена, и потеря этой функции существенна, но недостаточна для развития опухоли (Могосо J. R. et al., 1990].

Имеется достаточно фактов, позволяющих заключить, что инактивация или мутация антионкогенов (WT1, МСС — хромосома 5q, Rbl, р53, NF1, DCC (deleted in colorectal carcinoma) — хромосома 18q, Krev-1, Krev-2, Krev- 3, Krev-4, PCNA, семейство генов RAP и др.), ассоциированных со многими > злокачественными новообразованиями человека (ретинобластома, рабдомио­саркома, остеосаркома, карцинома молочной железы и мочевого пузыря, опухоль Вильмса, раки толстой и прямой кишок, нейрофиброма, нейроблас­тома, менингиома, мелкоклеточный рак легкого и другие нейроэндокринные опухоли), являются одним из общих механизмов онкогенеза: инициации и он; долевой прогрессии (Klein G., 1987; Green М. R., 1989; Sager R., 1989; bouL'.tein R. et al., 1990; Call К. M. et al., 1990; Fearon E. R. et al., 1990; Gessler M. et al., 1990; Howe J. A. et al., 1990; Lane D. P., Benchimol S., 1990; Lee W. H. et al., 1990; Levine A. J., MomandJ., 1990; Barbareschi M. et al., 1991; Hollingsworth R. E., Lee W. H., 1991; Browm K. et al., 1992]. Показано, что для всех этих опухолей туморогенность является рецессивным признаком (Pasquale S. R. et al., 1988].

Обнаружено, что накопление генетических мутаций в одной клетке при­водит к онкогенезу, а ряд синдромов с генетическими отклонениями предрас­полагает к последующему развитию опухолей (Levine A. J., 1990; Mitchell С. D., 1991]. Учитывая эти факты, считают, что онкогенез представляет собой пер­вично наследственную соматическую болезнь, являющуюся следствием на­копления (аккумуляции) нескольких генетических изменений (мутаций, пе­рестроек хромосом, амплификаций идр.). Эти изменения вызываются раз­личными агентами, повреждающими ДНК: опухолеродными вирусами, хими­ческими канцерогенами и др. (Ramel С., 1984;Todaro G. J., 1986; Temin Н. М., 1988,1990]. Проанализированы материалы по взаимосвязи цитогенетических изменений и злокачественных опухолей (лимфома Беркитта, фолликулярная лимфома, Т-клеточные новообразования, различные лейкозы, саркома Юин­га, мелкоклеточная карцинома легкого, карцинома молочной железы идр.). Обнаружены, например, потери аллелей из дистальной части короткого пле­ча хромосомы 1 на поздних стадиях опухолевой прогресси меланом, трансло­кация (Х:18) и потеря другой хромосомы X при синовиальных саркомах с перестройкой онкогена TLMP, потеря аллелей хромосомы 5 при семейных и спорадических аденомах ободочной и прямой кишок, утрата аллелей (утрата аллелей хромосомными плечами) Зр или 11р при опухолях мочеполовой системы (Dracopoli N. С. et al., 1989; Grdgoire М. J. et al., 1989; Lother R. A. et al., 1989; Ress M. et al., 1989; Solomon El et al., 1991]. В клетках рака молоч-

ной железы человека идентифицированы 11 различных мутаций, затрагиваю­щих гены с-myc, с-егЬВ2 и int-2, а также обнаружена утрата гетерозиготносте по 8 локусам хромосомы 6 (Gallahan R. et al., 1991; Trorlacius S. et al., 1991 J. Рассмотрены соотношения между рецессивными мутациями и злокачествен­ными новообразованиями (концепция рецессивных онкогенов, ретиноблас- тома и остеосаркома, опухоль Вильмса, синдром Бскуита — В идем ан а, не- йрофиброматоз, злокачественные опухоли и семейный полипоз ободочной и прямой кишок и другие бластоматозные процессы) [Seemayer Т. А., Cavenee W. К., 1989].

Большинство новообразований, согласно современным генетическим мо­делям онкогенеза, возникает как результат мутационной активации онкоге­нов в сочетании с рецессивной инактивацией генов-супрессоров (Fearon Е. R., Vogelstein В., 1990; Wynford-Thomas D., 1991 ]. Считают, что для возні." и < >- ния злокачественных опухолей требуются мутации 4—5 генов, а для добро ка­чественных опухолей — мутации меньшего числа генов. Предполагают так­же, что для возникновения злокачественных неоплазм накопление генетичес­ких изменений имеет большее значение, чем их последовательность в отно­шении одного к другому. Показано, что в некоторых случаях мутантные гены- супрессоры опухолей вызывают фенотипический эффект, даже если они на­ходятся в гетерозиготном состоянии, т. е. иными словами, эти некоторые гены-супрессоры опухолей могут не быть «рецессивными» на клеточном уров­не.

В пользу непосредственного участия мутаций в процессе онкогенеза сви­детельствуют следующие факты:, 1) как правило, необратимость злокачес­твенности клеток опухолй; 2) канцерогены и мутагены являются электрофи­лами, взаимодействующими с нуклеофильными центрами клеточных макро­молекул, главным образом ДНК; 3) большинство канцерогенов являются му­тагенами; 4) при канцерогенезе нарушается функция репарации ДНК; 5) при повреждениях ДНК активируются онкогены. Механизмы их активации связа­ны с точковыми мутациями типа сдвига рамки транскрипции и замены пар оснований, а также с хромосомными перестройками и транспозициями сиг- ментов ДНК. При этом важно подчеркунть, что постоянство генетической нестабильности в опухолевых клетках способствует расширению диапазона их фенотипического разнообразия и этот признак (в пределах определенной ткани) опухолеспецифический.

Помимо генетических изменений, активировать клеточные онкогены мо­гут и различные эпигенетические изменения,'в частности, гипометилирова­ние ДНК или продуктов генов (РНК и белки), ответственных за трансформа­цию [Spandidos D. А., 1986; Torsten U., 1986]. Изменения экспрессии онкоге­нов приводят к количественным или качественным изменениям их продук­тов, что выражается в последовательном формировании опухолевого феноти­па.

В настоящее время можно считать установленным, что трансформация in vitro, так же как и in vivo, осуществляется многоэтапно, причем каждый этап приводит к наследуемому изменению фенотипа. Определенный параллелизм проірсссии трансформированных клеток при культивировании и в организме животного позволяет отождествлять некоторые факты, полученные при ис­следовании процесса неопластического превращения в этих двух системах. Появление и развитие всех свойств, характерных для бластоматозной клетки, как правило, не коррелируют во времени. Следовательно, уже в первично

трансформированных (например, инфицированных опухолеродным вирусом) клетках проявляется основной принцип независимости прогрессии отдель­ных признаков. Такие первично трансформированные клетки чаще всего отличаются по своим свойствам как от нормальных, так и опухолевых кле­ток, основными биологическими свойствами которых являются нерегулируе­мый рост, способность к инвазивному росту, метастазированию, прогрессии и генерации разнообразия признаков и, наконец, их гетерогенность, как морфологическая, так и функциональная.

При исследовании трансформации in vitro можно более четко проследить последовательные стадии опухолевой эволюции клеток, первично контакти­ровавших с опухолеродными вирусами. С помощью метода клонирования удалось установить, что на первой стадии трансформации были только однос­лойные колонии, при пассировании которых возникали фокусы морфологи­чески измененных клеток с многослойным ростом в монослойной культуре. Обратного ггерехода не отмечалось. Опухоли in vivo при перевивке синген­ным животным или особям с иммунодепрессией возникали только при тран­сплантации клеток из многослойных колоний [DulbeccoR., 1976). Таким образом, термин «трансформированный фенотип» объединяет набор пере­численных выше признаков, а также способность клеток, обладающих этими свойствами, вызывать опухоли в системе in vivo. Вместе с тем при дальней­шем анализе механизмов вирусного онкогенеза было установлено, что пря­мая корреляция между наличием какого-либо из этих признаков (уменьше­ние зависимости способности клеток к размножению от твердого субстрата, пониженная потребность трансформированных клеток в сывороточных фак­торах, морфологические и кариотипические изменения и др.) и тумороген- ностью отсутствует или же вообще эти признаки не связаны со способностью клеток вызывать опухоли in vivo (Stanbridge Е. J., Wilkinson J., 1978; Sabin J. R., 1989; Klein G., 1981 ]. Следовательно, приведенные факты относительно тран­сформированного фенотипа могут рассматриваться как подтверждение точки зрения о том, что канцерогенез представляет собой многоступенчатый про­цесс, в основе которого лежат как минимум две мутации (Berenblum I., 1941; Knudson A. G., 1971, 1974—1975; Cline М., 1986; Klein G., 1987; Weinberg R. A., 1989].

На основании изложенного можно сделать главный вывод: клетки .приоб­ретают свойства, характерные для трансформированного фенотипа, в резуль­тате многостадийного процесса, в реализации которого участвует несколько онкогенов и антионкогенов. Например, экспериментально показано, что для превращения нормальных кератиноцитов в плоскоклеточные раки у бести- мусных мышей необходимо кооперативное функционирование двух онкоге­нов- v-fos и v-ras [Greenhalgh D. A. et al., 1990]. Установлено, что различные онкогены могут обусловливать возникновение одного типа оггухолей. У чело­века определена локализация онкогенов более 15 типов разных бластоматоз- ных процессов: нейробластомы, гепатобластомы, нейрофиброматоза, мно­жественных эндокринных опухолей, остеогенной саркомы и др. [Champeux S., 1989]. Необходимо также подчеркнуть, что многоступенчатый процесс, при­водящий к опухолевой трансформации, может осуществляться несколькими путями: включать последовательную активацию различных онкогенов или, наоборот, потерю антионкогена с последующей, например, амплификацией определенных онкогенов или же могут возникать сложные взаимодействия между интегрированными вирусными онкогенами и активацией клеточных

онкогенов с одновременной инактивацией антионкогенов идр. При этом всегда, как уже отмечалось, в процессе трансформации имеют место мута­ции, транслокации, делении, амплификации генов как минимум четырех огромных семейств: онкогенов, антионкогенов (супрессорные гены опухоле­вой трансформации), генов — модуляторов неопластического («антисоциаль­ного») поведения клеток и генов — эффекторов трансформации, непосред­ственно обусловливающих реализацию опухолевого фенотипа трансформи­рованных клеток. М. A. Tainsky и соавт. (1988), использовав клетки человека для изучения модели многостадийного канцерогенеза, сделали предположе­ние, что к возникновению опухолевого фенотипа приводят три главных собы­тия: иммортализация клеток, активация онкогенов (мутировавших) и инакти­вация генов-супрессоров трансформирующих генов. При этом следует доба­вить, что критическим моментом опухолевой трансформации, очевидно, яв­ляется не столько порядок этих молекулярных событий, а сколько само нали­чие их определенного сочетания. Вместе с тем вполне понятно, что сложней­ший многоэтапный процесс опухолевой трансформации не может быть све­ден только к обсуждаемым молекулярно-генетическим взаимодействиям в столь упрощенном виде, как активация онкогенов и инактивация антионко­генов, а также к функционированию генов-эффекторов трансформации и т. д.

Язя всестороннего изучения многоступенчатости канцерогенеза разрабо­таны различные экспериментальные модели. В частности, предложена мо­дель многостадийного онкогенеза рака молочной железы, включающая про­грессивные изменения клеточных онкогенов и нарушения регуляторных фун­кций генома [Farber Е., 1984; Weinstein I. В., 1984; Oliffa A. et al., 1985; Morris D. W., Cardiff R. D., 1987; Kaldor J. M., Xavier B. F., 1990]. Заслужи­вает внимания математическая многостадийная модель канцерогенеза, позво­ляющая оценивать риск развития рака в человеческой популяции в зависи­мости от факторов внешней среды [Moolgavkar S. Н., 1989]. Модель согласу­ется со многими экспериментальными и эпидемиологическими данными, дает возможность предсказывать результаты различных режимов канцероге­неза в аспекте инициации — промоции.

Представлены доказательства многофакторной природы канцерогенеза эпи­телиальных клеток человека in vitro. Показано, что злокачественная тран­сформация этих клеток обусловливается функционированием онкогенов Ha­ras, myc, fes, fms, crbB и sre [Rhim J. S. et al., 1990]. Линия эпидермальных кератиноцитов человека НЕК-1 предлагается в качаетсве модельной системы для изучения многофакторного канцерогенеза различной природы. Наконец, описана математическая модель возникновения опухоли, основанная на ги­потезе A. G. Knudson о роли последовательных мутаций в двустадийном кан­церогенезе. Эта смешанная математическая модель канцерогенеза с приме­нением к ретинобластоме учитывает соотношение скорости пролиферации и дифференцировки нормальных клеток, скорости перехода нормальных кле­ток и «промежуточных» клеток в опухолевые, а также независимость наступ­ления мутации от соотношения пролиферации и дифференцировки [Tan W. Y , Singh К. Р., 1990]. Обнаружено хорошее совпадение данных о частоте рети- нобластом, полученных Национальным институтом рака (США), с данными, предсказанными на основании математической модели.

Существенно, что единственным общим признаком для всех популяций неопластически трансформированных клеток являются эмбрионизация, в том числе и экспрессия поверхностных эмбриональных опухолеассоциирован­

ных дифференцировочных антигенов, представляющих собой одну из наибо­лее постоянных форм изоантигенов злокачественных клеток. Появление этих консервативных и стабильных в опухолевой прогрессии антигенов может быть обусловлено либо реэкспрессией генов (фенотипическая реверсия к ранним стадиям), либо озлокачествленисм тканей, заведомо содержащих эти антигены (Агеенко А. И., 1979—1982; Эренпрейс Я. Г., 1979,1982,1984,1992; Абелев Г. И., 1980;Олснев Ю. М., 1977; Goggin J. Н. et at, 1970; Alexander Р., 1972; Fishman W., Singer R., 1975; Ibsen К. H., Fishman W. H., 1979; Pito H. C., Sirica A., 1980; Saline J., 1980; Adams S. L. et al., 1982; Pasternak G., 1984J.

Анализ многочисленных данных литературы свидетельствует о том, что в процессе опухолевой трансформации происходит скорее всего нс изолиро­ванный синтез какого-либо отдельною эмбриональною белка (т. е. признак случаен по отношению к опухолевой ткани и представляет собой нсспецифи- ческое нарушение программы нормального развития), а направленная эк­спрессия многих, по-видимому, взаимосвязанных эмбриональных признаков (морфологических, биохимических, иммунологических и молекулярно-био­логических). В этом отношении особый иггтсрес представляет активация синтеза в процессе неопластической трансформации онкоэмбрионального фибронектина — основного белка клеточных мембран, который определялся с помощью MAT (Matsuura Н., 1985]. С этим белком ассоциированы такие свойства и признаки клеток, как адгезивность, морфологические особеннос­ти, организация цитоскслста, миграция, дифференцировка, опухолевая транс­формация, фагоцитоз, участие в гемостазе (Eskandarani Н. A., Agad S. R., 1989]. Выделен и охарактеризован связывающий фибронектин ФР с молекулярной массой 25 ООО, стимулирующий образование колоний в мягком агаре неоп­ластически трансформированных клеток. По структурным и хроматографи­ческим свойствам этот фактор роста был сходен с (3-ТФР.

Демонстративны результаты исследований R. Klingel и соавт. (1990). Ав­торы изучали экспрессию и функциональное значение стадиоспецифических дифференцировочных эмбриональных эпителиальных антигенов Ехо-1 и ЕРМ- 1 при созревании эпидермальных кератиноцитов человека, а также в добро­качественных и злокачественных опухолях, происходящих из этих клеток. В период фетального развития Ехо-1 временно экспрессируется в клетках про­межуточного слоя, а затем его синтез прекращается в клетках кожи взрослых людей. Реэксперссия этого белка вновь возобновляется в клетках доброкачес­твенных и злокачественных новообразований. Таким образом, антиген Ехо-1, являясь маркером ранней эмбриональной дифференцировки кератиноцитов, может свидетельствовать об изменении экспрессии клеточного генома, свя­занном с определенной стадией гиперпролиферации.

Важно особо подчеркунть, что эмбрионизация опухоли устойчива в опу-,{ холевой прогрессии, т. е. является константным свойством неопластичсски трансформированных клеток в отличие от мозаики признаков, присущих дефинитивным тканям. Эти признаки весьма разнообразны и непостоянны. Функциональное значение реализации эмбриоспецифической программы, которая осуществляется в процессе опухолевой трансформации клеток, под­робно анализируется в последующих главах.

Следует обритить внимание на то, что изменение характера роста тран­сформированных клеток является наследственно закрепленным свойством, которое не зависит от размножения вируса или присутствия какого-либо канцерогенного фактора и сохраняется на протяжении длительного пассиро­

вания in vitro и in vivo. Это свойство присуще и клонам, полученным от одной трансформированной клетки, что дает возможность количественно учесть частоту трансформации клеток, инфицированных опухолеродным ви­русом. К настоящему времени трансформация клеток in vitro практически воспроизведена всеми известными опухолеродными вирусами. Статистичес­кий анализ многих из этих тест-систем показал, что каждый фокус трансфор­мации может быть индуцирован одной вирусной частицей. По числу этих фокусов в данной культуре, зная дозу вируса, можно определить трансформи­рующий потенциал вируса и выразить его титр в фокусообразующих едини­цах (ФОЕ).

В заключение этого раздела следует отметить, что нерешенных проблем, связанных с опухолевой трансформацией, в настоящее время больше, чем решенных, хотя и выявлены многие общие молекулярные механизмы, обус­ловливающие превращение нормальных клеток в опухолевые при разных типах канцерогенеза в различных экспериментальных системах in vitro и in vivo, а также при спонтанных новообразованиях животных, в том числе и некоторых опухолях человека. Весь этот фактический материал позволяет предполагать, что установленные на экспериментальных системах общие закономерности опухолеобразования и в перую очередь многостадийность процесса, вероятно, относятся к естественно возникающим опухолям. Следо­вательно, макромолекулярные механизмы канцерогенеза, по-видимому, име­ют общие закономерности, присущие всем типам злокачественных новообра­зований, включая и опухоли человека. Эти общие звенья онкогенеза любого происхождения прежде всего свидетельствуют о последовательной актива­ции определенных протоонкогенов и супрессии антионкогенов и означают, что молекулярно-биологические изменения клеточного генома первичны, а сама опухоль представляет собой систему клеточных клонов (экосистему), в которой постоянно происходит как стабилизирующий, так и прогрессивный (проірессия опухоли) отбор.

При этом крайне важны два аспекта этой проблемы. Во-первых, в само- поддерживающейся опухолевой экосистеме всегда присутствует клон, обла­дающий свойством стволовых клеток, т. е. определяющий развитие других клонов этой системы. Вследствие этого, несмотря на разнообразие кариоти­пических характеристик, в каждой опухоли можно выделить определенные соотношения именно для этой опухоли числа клеток с данными конкретны­ми характеристиками. Этот феномен «клонального доминирования» прежде всего имеет важное значение для понимания единого источника биологичес­кой вариабельности в экспериментах, в которых различные первичные опу­холи сравнивают между собой и с метастазами, и, главное, может «прими­рить» многочисленные противоречия, возникающие при этом, относительно возможной селективной природы метастатического фенотипа. Данный фено­мен несомненно влияет на теории о клональном происхождении опухолей. Во-вторых, оба селективных отбора (стабилизирующий и прогрессивный), очевидно, используют элементы регуляции нормальной клеточной диффе­ренцировки. Иными словами, в опухоли представлены все элементы нор­мального контроля и, что удивительно (это первостепенный вопрос биологии опухолевого роста), в условиях генетической нестабильности неопластичес­ки трансформированных клеток в опухолевой системе преобладает стабили­зирующий отбор, сохраняющий одновременно ее индивидуальное развитие (проірессию). Последнее обеспечивает иммортализацию трансформирован-

ных клеток, генерирующих разнообразие клеточных клонов, способных к генетическим и модификационным изменениям.

Таким образом, в опухолевой системе всегда функционируют два основ­ных уровня регуляции: молекулярно-генетический и популяционный. При­чем клеточные клоны, составляющие опухоль, содержат наборы генов, доста­точных и необходимых для нормальной дифференцировки. При этом всегда необходимо помнить, что генетическая детерминация «злокачественности» опухолевой клетки представляет собой сложный процесс, затрагивающий множественные структурные и функциональные уровни генома, естественно, несовместимые с простыми моделями активации или депрессии генов. Ины­ми словами, онкогенез — это сеть взаимодействующих явлений, ведущих к появлению автономной и самоподдсрживающсйся клональной опухолевой прогрессии (как правило, летальной для организма).

Мутации имеются и в процессе прогрессии неопластически трансформи­рованных клеток, однако в этих случаях они носят вторичный характер. В то же время, вероятно, существуют и негенетические механизмы инициации опухолевой трансформации, поскольку в некоторых случаях канцерогенез может реализоваться эпигеномными путями вследствие нарушения нормаль­ного эпигенетического контроля активности генов специализированных кле­ток |RamelC., 1984; Holliday R., 1987). На подобный механизм неопласти­ческой трансформации указывают прежде всего эксперименты по трансплан­тации ядер из клеток опухолей в цитоплазму нормальных клеток, в результа­те чего получается нормальное потомство (Ramel С., 1984)..