ОНКОГЕНЫ И ОПУХОЛЕВАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ КЛЕТОК

Как видно из приведенного выше огромного фактического материала, принципиальный прогресс в исследовании феномена опухолевой трансформации, по данным литературы, выразился лишь в расшифровке механизмов, устанавливающих функциональные связи между генетическими, структурными и эпигенетическими изменениями, вызываемыми опухо­леродными вирусами, химическими канцерогенами и другими этиологичес­кими факторами как отдельными деталям и этого процесса, т.

В настоящее время можно считать твердо доказанным, что трансформа­ция клеток in vitro осуществляется только после активации и транскрипции нескольких мутантных онкогенов и функционирования их продуктов. Многообразные трансформирующие эффекты онкогенов, очевидгго, обусловливаются либо плейотроггным, либо каскадным механизмом действия их белков (в некоторых случаях и тем и другим). Взаимодействуя с клеточными регуляторными элементами, эти белки приводят к формированию опухолевой) фенотипа. При этом крайне важно обратить внимание ггато, что существенным звеном опухолевой трансформации, как это недавно обнаружено, является кооперация определенных онкогенов друг с другом и со специфическими клеточными структурами, в частности с антионкогенами, регуляторными белками и белками, способствующими трансформации (кодируются генами — эффекторами трансформации).

Онкогены, функционально взаимодополняющие последовательно или од­новременно и совместно обусловливающие процесс онкогенеза, названы ком­плементарными. Эти онкогены могут как входить в состав генома одною опухолеродною вируса (МН2, Е26, AEV), так и функционировать после активации в качестве комплементарных пар. Определены наиболее часто действующие в неопластически трансформированных клетках следующие пары: myc и ras, р53 и ras, ras и bcl-2, ras-mpt и FBR, myc и mil, myc и Blym-1, myc и sre, El А и ras, myc и raf, myc и erb A, abl и myc, ras и fos, myb-ets и

myc, mil и ras. Обычно один из членов комплементарной пары является онкогеном иммортализации, а второй — геном промоции или неопластической трансформации. Установлено также, что в комбинации с одной и той же формой онкогена v-myc разные формы v-raf индуцируют различный спектр опухолей (Агеенко А. И., 1986; Vogt М. et al., 1986; Amoucl Р. ct al., 1989; Alexander К., Galland P. 1989; Greenhalgh D. A. et al., 1990; Kuric J. M. et al., 1990; Richards C. A. et al., 1990; Rosenbaum H. et al; 1990; Samarut J., 1990). Сконструированы различные рекомбинантные молекулы ДНК, содержащие разные сочетания онкогенов, в частности, например, ранний район генома паповавируса человека ВК и активированные онкогены *овека c-Ha-ras или c-myc, эффективно трансформирующие эмбриональные клетки человека (Corallini A.

Обнаружено кооперативное участие продуктов генов с-jun, jun-B, jun-D и c-fos в трансактивации комплекса АР-1 (транскрипт АР-1 обычно экспрессируется в клетках, стимулированных ФР) и злокачественной трансформации клеток (Dixit V. М. et al., 1989; Schutte J. etal., 1989; Smeal T. et al., 1989). Установлено, что продукт транскрипции АР-1 опосредует индукцию генов такими промоторами, как различные ФР и коллагеназные промоторы. Белки c-jun, jun-B и jun-D связываются (или как гомодимеры, или как jun-fos-гетеродимсры) с элементом в составе комплекса АР-1, отвечающим на воздействие ТФР.

Методами генной инженерии определена кооперация онкогенов v-jun и v- егЬВ при трансформации эмбриональных фибробластов кур (CEF) in vitro и in vivo (Garcia М., Samarut J., 1990). Прямая ДНК-транскфскция куриных эмбриональных фибробластов различными онкогенами (sre, егЬВ, myc и ras) и гена пей либо поодиночке, либо в комбинации обусловливала трансформацию этих клеток in vitro (с уникальной морфологией), а в некоторых случаях приводила и к образованию опухолей in vivo (Antczak М., Kung Н. J., 1990).

Необходимо особо подчеркнуть, что трансактивирующие гены лимфопро­лиферативных ретровирусов (вируса лейкоза крупного рогатого скота, вируса Т-клеточного лейкоза человека и HIV), а также открытые З’-рамки считывания эндогенного и экзогенного вируса рака молочной железы мышей (вводили с помощью трансфекции в клетки NIH/3T3, затем их инокулировали иммунодефицитными мышами nude) вызывали опухоли у мышей. ДНК этих новообразований содержали соответствующие трансреіуляторньїе гены (Van Klavcren Р. etal., 1989).

Совместная и последовательная активация онкогенов выявлена во многих опухолях человека разных гистогенеза и локализации. Например, в клетках рака ротовой полости описана активация гена c-Ha-ras 1 (мутация кодона 13) с сопутствующей амплификацией генов c-erb В1 и c-myc (Tadokoro К. et al., 1989). При раке женских половых органов выявлены амплификация и перестройка протоонкогенов c-crb В1, кодирующего рецептор для ФР эпидермиса (ФРЭ), и c-erb B2/neu, кодирующего белок, сходный с рецептором для ФРЭ (Zhang X.

Установлена кооперация различных онкогенов в процессе неопластической трансформации разнообразных клеток человека, в частности описаны редкие варианты, например опухолевая трансформация онкогенами EJ/ras и пси клеток мочевого пузыря, иммортализированных SV40 (Christian В. J. et al., 1990 J В опухолях, возникших из этих клеток, трансплантированных бестимусным мышам, обнаружены значительные количества р21^г“, но корреляция между уровнем этою белка и туморогенностью отсутствовала.

Итак, несвоевременная (независимо от стадии клеточной диф­ференцировки), стабильно усиленная экспрессия как минимум двух онкоге­нов, сочетающаяся, как правило, с мутацией в самом гене (возникновение мутантных аллелей) в кооперации со специфическими клеточными структу­рами и регуляторными белками поэтапно приводит к формированю опухоле­вою фенотипа.

Определенно участие многих онкогенов в регуляции пролиферации и диф­ференцировке клеток, а в некоторых случаях была выявлена даже и структур-¹ ная общность их продуктов с ФР. ФР, как известно, вызывают индукцию экспрессии набора генов раннего пролиферативного ответа. Прототипами последних, как отмечалось, являются в том числе протоонкогены c-fos и с-' jun, участвующие в регуляции клеточною деления. Онкогену c-fos отводят < роль главного переключателя, обеспечивающего геномные реакции на другие онкогены или на внешние факторы. Определены три осноыньгх механизма влияния гена fos на экспрессию генов: 1) активация (в комплексе с онкобсл- ками jun) транскрипции генов, зависимой от фактора АР-Г, 2) ауторепрессия промотора c-fos; 3) репрессия транскрипции генов, стимулированная рецеп­тором глюкокортикоидов.

Таким образом, транскрипционные комплексы протоонкогена c-fos име­ют альтернативные кофакторы в отношении различных факторов стимуля­ции. Существенно, что при этом стратегия изменений активности клеточного генома в процессе опухолевой трансформации иногда включает изменение функционирования системы ФР. Это проявляется в форме увеличения либо активности самого ФР (-ов), либо числа рецепторов к нему. Причем в последнем случае оказалось, что рецептор может утрачивать регуляторный і участок, сохраняя ферментный, и тем самым постоянно стимулировать пролиферацию опухолевых клеток в отстутсвие ФР. Крайне важно отметить, что стабильная экспрессия некоторых онкогенов, например с-тус, обеспечи­вает постоянный ответ трансформированных клеток на действие различных ФР, в то время как другие онкогены (ras) вызывают усиленную продукцию этими клетками трансформирующих факторов и ФР. ФР также оказапись способными усиливать транскрипцию определенных онкогенов (myc, fos, jun

идр.), которые в свою очередь моїут регулировать транскрипцию других генов, необходимых для пролиферации. Обобщение всех этих фактов позво­лило выдвинуть новую гипотезу аутокринного механизма поддержания опу­холевого роста, который действительно весьма эффективно функционирует в некоторых опухолевых системах.

Обоснованно также участие в лейкомогенезе макрофагального КСФ (М- КСФ). Он является гликозилированным полипептидным ФР, продуцируется различными мезенхимными клетками, а также моноцитами и макрофагами при стимуляции их форболовыми эфирами, у-интерфероном, гранулярно­макрофагальным КСФ (ГМ-КСФ) или а-ФНО. В отличие от других гемопоэтических КСФ М-КСФ в норме циркулирует в крови, и его концентрация регулируется через опосредованный рецепторами захват моноцитами и тканевыми макрофагами [SherrC. J. et al., 1988]. Рецептор М- КСФ кодируется протоонкогеном c-fms и является трансмембранным гликопротеидом. Рецептор М-КСФ по аминокислотной последовательности тесно связан с рецептором ТрФР и продуктами онкогена c-Kit.

Выделен и охарактеризован ФР из клеток В-клеточной лимфомы человека ISahasrabuddhe С. G. et al., 1989]. Этот внутриклеточный белок с молекулярной массой 60 000 содержится в опухолевых и нормальных В-клстках и секретируется ими в среду. В-клетки экспрессируют на поверхности рецептор к нему. Считают, что активность В-клеточного ФР важна в процессе неопластической трансформации В-клеток.

Установлено, что ранние события антипролиферативного действия ФНО сходны с ранними событиями стимуляции роста, вызванной ФРЭ I Donato N. J. et al., 1989]. Оказалось, что способность ФНО к модуляции активности тирозиновой протеинкиназы рецептора ФРЭ в клетках-мишенях (опухолевые линии, чувствительные и резистентные к ФНО) коррелирует с цито­токсичностью ФНО. Показано также, что ФРЭ и ФНО индуцирует актив­ность орнитиндекарбоксилазы и экспрессию протоонкогена c-myc в эпители­альных клетках, а это влияет на их опухолевую трансформацию.

Анализ участия в неопластической трансформации клеток онкогенов раз­личных опухолеродных вирусов дает также основание сделать общее заклю­чение. На фоне исключительной плейотропности действия продуктов их тран­сформирующих областей прежде всего доминирует их способность регулиро­вать пролиферацией на нескольких уровнях организации генома клетки од­новременно, как минимум на двух: генетическом и структурном. Генетичес­кий уровень обусловливается влиянием продуктов вируса (ранних — в случае ДНК-содержащих опухолеродных вирусов) на транскрипционную систему клетки. Вследствие этого активируются или, наоборот, репрессируются кле­точные гены, обусловливающие регуляцию пролиферацией. Эта категория генов, очевидно, включает несколько групп: во-первых, гены, функциониро­вание которых обеспечивает биосинтетические процессы, связанные с про­движением клетки по циклу; во-вторых, активацию генов ФР и их рецепторов; в-третьих, активацию онкогенов, подавляющее большинство которых кодирует

¹ Имеется в виду взаимодействие продуктов оп уходе роди ого вируса со структурными образовани­ями ядра и конформационными переходами хроматина.

протсинкиназы-фосфатазы, изменяющие активность ферментов и образую­щие энзиматические цепи от поверхностной мембраны к ядру. Понятно, что взаимодействие именно семейств этих генов главным образом влияет на регуляцию клеточного деления. Причем есть основания полагать, что продвижение клетки по циклу, вероятнее всего, не является следствием прямой однонаправленной по цепочке передачи сигнала от ФР в ядро, а обусловливается концентрацией вторичных внутриклеточных посредников и ассоциированных с ними белков, т. е., иными словами, имеет место аутоколебательный процесс. При разных концентрациях ФР различаются такие параметры системы, как константы скорости синтеза и распада вторичных мессенджеров, аутоколебания происходят только в определенном диапазоне концентраций ФР {Романчиков Ю. М., 1991]. При слишком малых и слишком больших концентрациях ФР клетки делиться нс будут. Такой подход позволяет объяснить синергизм действия ФР, их двоякую роль как активаторов и иншбиторов делений, разную длительность цикла.

Что касается регуляции пролиферации клеток на структурном уровне¹, можно предполагать, что именно этот механизм обусловливает блокирование клеточных генов, регулирующих нормальную пролиферацию.

Ранее было отмечено определенное сходство между вирусными фосфоп­ротсинкиназами и ЭФР, который связывается со специфическими рецепторами клеток, индуцирует последовательную цепь процессов, приводящих к размножению и росту клеток. Установлено, что ЭФР стимулирует цАМФ- независимую специфическую фосфокиназу, фосфорилирующую в клетках карциномы человека белок с молекулярной массой 34 (XX). Последний осаждается антисывороткой против белка с молекулярной массой 34 000 из клеток кур. Этот белок, как известно, является мишенью для фосфорилирования рр6О^,те. Оказалось, что как киназа рр60*^гс, так и фермент, стимулированный ЭФР, способны фосфорил ировать белок с массой 34 ООО. В клетках фосфо­рилирование данного белка возрастает в А—5 раз, причем оно происходит по тирозиновому остатку при действии как ррбО”*, так и ЭФР JErikson Е. et al., 1981]. Хотя остается неясным, какая специфическая киназа фосфорилирует указанный белок при стимуляции ЭФР, авторы цитируемой работы подчер­кивают, что один из ответов на действие ЭФР идентичен ответу при вирусной трансформации.

В свете обсуждаемых факторов особое значение приобретают данные, полученные при сравнительном исследовании первичной структуры полипептидных фрагментов рецептора ЭФР и первичной структуры онкобелка v-erb В AEV {Downward), et al., 1984]. Обнаружено совпадение 74 и 83 аминокислотных остатков. Рецептор ЭФР человека состоит из трех доменов: 1) наружного, экстрацеллюлярного, связывающего ФР; 2) трансмембранного; 3) внутрицитоплазмэтического, обладающего специфической протеинкиназной активностью и несущего участки аутофосфорилирования (остатки тирозина в терминальной трети домена). Авторы отмечают, что пептиды рецептора ЭФР, гомологичные c-erb В, представляют собой фрагменты трансмембранного и внутрицитоплазматического доменов (различие аминокислотных пеледователь- ностей превышает 3%). Поскольку гены рецептора ЭФР и c-erb В человека локализованы в одном и том же районе хромосомы 7, логично предположить, что ген с-erbB кодирует рецептор ЭФР или тесно сцеплен с геном этого рецеп­тора. Предшественник AEV мог включить в свой гоном часть гена c-erb В, соответствующую цитоплазматическому и трансмембранному демону рецепто­

ра. Следовательно, трансформация клеток этим вирусом, по-видимому, обус­ловил вается синтезом в них рецептороподобного белка, стимулирующего рост клеток, но нс поддающегося регуляции ФР.

В последующем было показано, что молекула белка (продукта в обеих системах — c-erb В и ЭФР) разделена трансмембранной областью на лигаи- дсвязывающую внеклеточную часть и на внутриклеточную цитоплаз­матическую регуляторную область. Удаление лигандсвязывающей области приводит к эритробластозу у птиц, а изменение последовательностей в кор- боксильном окончании может влиять на бластомогенную специфичность этих продуктов протоонкогена c-erb В (Maile N. J., Kung Н. J., 1988J. Амплифика­ция и перестройка гена ЭФР коррелирует с возникновением большой) числа злокачественных опухолей человека. Таким образом, все представленные факты свидетельствуют о важности рецепторов ЭФР в регуляции клеточного деления и позволяют предполагать ключевую роль этих молекул в формиро­вании последовательных стадий развития опухолевой трансформации.

Итак, из всей представленной огромной «лавины» фактическою материа­ла можно выделить и суммировать только следующие, имеющие принципи­альное, основополагающее значение: 1) представление об опухолевой про­грессии L. Foulds; 2) концепция онкогена (включающая антионкогены и гены- эффекторы трансформации); 3) обнаружение постоянного маркера всех нс­опластичсски трансформированных клеток, а именно эмбриональных стади- оспепифических, дифференцировочных поверхностных антигенов; 4) гене­тическая нестабильность опухолевых клеток, являющаяся одним из основных механизмов активации определенных нротоонкогенов иди, наоборот, инак­тивации антионкогенов, которые обязательно (как было недавно показано) функционируют в кооперации друг с другом и со специфическими клеточны­ми структурами и различными регуляторными белками, в том числе осущес­твляющих негативную регуляцию, обусловливая неопластическую трансфор­мацию клеток; 5) центральная проблема онкологии — проблема взаимоотно­шений иммунитета и канцерогенеза с позиций новой философии.

Учитывая постоянное присутствие на поверхности всех нсопластичсски трансформированных клеток эмбриональных, стадшкпецифичсских, диф­ференцировочных антигенов, возникла мысль, а не являются ли эти эволюци­онно консервативные и наиболее стабильные в опухолевой прогрессии струк­зуры структурами, обеспечивающими самоподдержание опухоли. Иными сло­вами, не являются ли эти эмбриональные белки субстратом для пролифера­тивною стимула опухоли и генерирования фенотипического разнообразия? Эти предположения были экспериментально подтверждены в лаборатории вирусологии и клинической иммунологии МНИОИ им. П. А. Герцена, и на этих фактах была сформулирована новая концепция канцерогенеза (см ниже).