<<
>>

Исследование активности естественных клеток-киллеров

Оценку активности естественных клеток-киллеров проводят по показателю естественной цитотоксичности (ЕЦ) спектрометрическим (нерадиометрическим) методом Гордиенко С. М., 1983, 1984], где клетками-эффекторами служили спленоциты крыс, а клетками- мишенями - эритроциты кур (ЭК) [Белокрылов Г.

А. и соавт., 1980]. Очищенную взвесь лимфоцитов получают, удаляя прилипающие клетки инкубацией в колонках с нейлоновой ватой. Эффекторные клетки взвешивают в концентрации 107 клеток в 1 мл питательной среды следующего состава: среда № 199 с добавлением до 10% истощенной ЭК эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамина (300 мкг/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 Ед/мл). В ходе опыта обеспечивали соотношение эффектор - мишень 10:1, при этом концентрация клеток-мишеней (ЭК) составляла 106 в 1 мл питательной среды. Цитотоксический тест ставят в пластиковых камерах «Linbro» (76-013-05) с круглым дном. Результаты реакции учитывают по спектрофотометрическому определению концентрации гемоглобина, выделившегося из неразрушенных ЭК. В опытные лунки добавляли по 0,1 мл взвеси эффекторных клеток и по 0,1 мл взвеси ЭК. Проводят 3 контроля: эффекторные клетки в питательной среде без ЭК; питательная среда; взвесь ЭК в питательной среде без эффекторов. В конце инкубации содержимое лунок осторожно ресуспендируют и камеры центрифугировали 5 мин при 100g. 0,2 мл надосадка переносят в другие свободные ряды микропластины, а к осадку приливают 0,2 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия (ДСН) для лизиса ЭК, оставшихся неразрушенными в ходе цитотоксической реакции. Оптическую плотность осадков измеряют в специально изготовленных микрокюветах с длиной оптического пути 1 см и объемом 0,1 мл на спектрофотометре при длине волны 413 нм. Определяли количество гемоглобина, выделившегося из неразрушенных ЕКК ЭК, путем лизиса осадка 0,25% ДСН.
Индекс цитотоксичности (ИЦ) определяли по формуле:

где Ек - оптическая плотность лизированного осадка ЭК контроль

ной пробы без эффекторов против лизирующего раствора; Ео - оптическая плотность лизированных оставшихся в осадке

опытной пробы неразрушенных ЭК против лизированного осадка эффекторных клеток без ЭК.

Естественную цитотоксичность in vitro определяют спектрофотометрически описанным методом после инкубации клеток- эффекторов, получаемых из спленоцитов крыс, в течение 4 ч в среде 199 с содержанием токсикантов в концентрациях 1, 10, 100 и 1000 мМ. В ходе опыта обеспечивается соотношение эффектор-мишень 10:1 (или 25:1, 50:1). Результаты реакции учитывают по

спектрофотометрическому определению концентрации гемоглобина, выделившегося из неразрушенных ЭК.

Кроме того, существует радиометрический метод оценки активности ЕКК с использованием 51 Ст. Результат учитывают по высвобождению 51 Ст из меченых клеток определенных опухолей [Ройт А. и соавт., 2000]

<< | >>
Источник: Забродский П.Ф., Мандыч В.Г.. Иммунотоксикология ксенобиотиков: Монография. - СВИБХБ, 2007,- 420 с.. 2007

Еще по теме Исследование активности естественных клеток-киллеров: