Культуральные методы для клеток крыс

Выделение фракции мононуклеарных клеток (MHK)

Выделение мононуклеарной фракции клеток проводили на градиенте фиколла («ПанЭко», Россия) аналогично выделению мононуклеаров здоровых доноров.

Выделение моноцитов из MHK

Выделение моноцитов из MHK проводили методом адгезии. Собранные моноциты использовали для приготовления суспензии с концентрацией 0,5 млн клеток/мл. Среда состояла из 500 мл среды RPMI, 5 мл пирувата натрия (11 мг/мл), 146 мг глутамина, 50 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 3 мкл Р-меркаптоэтанола, 5 мл IOOx Antibiotic Antimycotic Solution (10,0 единиц пенициллина, 0,10 мг стрептомицина и 0,25 мкг амфотерецина В на мл Ix раствора). Для этого производили подсчет всех выделенных клеток в камере Горяева в 5 больших учетверенных квадратах. Для адгезии помещали клеточную суспензию в 24-луночные пластиковые культуральные планшеты из расчета 1 мл на лунку. Клетки инкубировали в течение 2 часов в CCb - инкубаторе во влажной атмосфере 5% CCb при +37°С. По окончании адгезии содержимое лунок аспирировали несколько раз, удаляя неадгезированную фракцию клеток. Среду в лунках заменяли равным объемом (1 мл) полной питательной среды с цитокинами (20 нг/мл IL4 («ProSpec», США) и 20 нг/мл GM-CSF («ProSpec», США)).

Стимуляция и культивирование моноцитов

Для стимуляции клеток добавляли негидролизуемый аналог аденозина - NECA в концентрации 100 мкМ и инкубировали 72 часа в CCb - инкубаторе во влажной атмосфере 5% С02 при +37°С. В контрольной группе к клеткам добавляли растворитель NECA - диметилсульфоксид (DMSO).

По окончании времени культивирования клетки отмывали с поверхности планшета и центрифугировали при 650g в течение 10 минут при температуре 20° С. После чего осадок ресуспендировали в 1 мл среды RPMI- 1640 и производили подсчет клеток в камере Горяева в 5 больших учетверенных квадратах. Готовили на основе среды RPMI-1640 клеточную суспензию, содержащую 300 тыс. клеток на 1 мл. После приготовления клеточную суспензию набирали в инсулиновый шприц и помещали в CCb - инкубатор до момента использования клеток в эксперименте (не более 1,5 часов).

2.3.2