Культуральные методы для клеток человека
Выделение фракции периферических мононуклеарных клеток (MHK)
В стерильных центрифужных пробирках объемом 50 мл («Falcon», США) разбавляли венозную кровь 1:1 раствором Хэнкса («Sigma», США).
Под 30 мл полученной смеси подслаивали 13 мл раствора фиколла (1,077 г/мл, «ПанЭко», Россия). Полученный градиент центрифугировали в течение 30 минут с ускорением 504g при температуре 20°С. Далее собирали мононуклеарную фракцию на границе раздела фаз и переносли в новые стерильные центрифужные пробирки. Для отмывки полученных клеток от примесей фиколла объем клеточной суспензии доводили до 50 мл раствором Хэнкса и центрифугировали 20 минут с ускорением 165g при температуре 20°С. C помощью аспиратора удаляли супернатант, осажденные клетки ресуспендировали в 1 мл раствора Хэнкса. Полученный объем смеси повторно доводили до 50 мл раствором Хэнкса и центрифугировали 20 минут с ускорением 165g при температуре 20°С.Выделение моноцитов из MHK венозной крови
Выдление моноцитов из фракции мононуклеаров проводили методом центрифугирования в двойном градиенте плотности перколла (1,131г/см3, «Sigma»,США). Готовили 10-кратный забуференный фосфатный раствор: 25 г NaCl, 0,25 г NaiHPCN, 4,2 г KH2PCN доводили дистиллированной водой до 400 мл, рН=7,2-7,4. Далее готовили стандартный изотонический раствор перколла (с плотностью 1,123 г/мл): к 1 мл 10-кратного забуференного фосфатного раствора добавляли 9 мл перколла с плотностью 1,131 г/мл. После чего готовили раствор перколла с плотностью 1,064 г/мл (5226 мкл стандартного изотонического раствора перколла смешивали с 5776 мкл RPMI) и 1,032 г/мл (750 мкл стандартного изотонического раствора перколла смешивали с 4250 мкл RPMI).
Полученные после отмывки от фиколла мононуклеары ресуспендировали в 1 мл среды RPML Добавляли 1,5 мл стандартного изотонического раствора перколла. Полученную смесь переносили в новые 15 мл стерильные центрифужные пробирки.
C помощью одноразового шприца наслаивали 5 мл раствора перколла с плотностью 1,064 г/мл, после чего сверху наслаивали 2 мл раствора перколла с плотностью 1,032 г/мл. Полученный градиент центрифугировали в течение 50 минут с ускорением 2058g при температуре 20°С. Верхнее кольцо, содержащее фракцию моноцитов, собирали пастеровской пипеткой и переносили в чистую 50 мл пробирку. Объем клеточной суспензии доводили раствором Хэнкса до 30 мл. Центрифугировали в течение 15 минут с ускорением 659g при температуре 20°С. После отмывки от перколла проводили подсчет количества клеток в камере Горяева.Далее на основе адгезионной среды готовили клеточную суспензию с концентрацией 0,5 млн клеток/мл. Адгезионная среда состояла из 500 мл среды RPMI, 5 мл пирувата натрия (11 мг/мл), 146 мг глутамина, 10 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 3 мкл Р-меркаптоэтанола, 5 мл 100х Antibiotic Antimycotic Solution («Sigma», США) (10,0 единиц пенициллина, 0,10 мг стрептомицина и 0,25 мкг амфотерецина В на мл Ix раствора). Клеточную суспензию помещали в 24-луночные пластиковые культуральные планшеты из расчета 1 мл на лунку, после чего инкубировали клетки в течение 2 часов в СОг - инкубаторе во влажной атмосфере 5% С02 при +37°С.
Стимуляция и культивирование моноцитов
По окончании инкубации содержимое лунок аспирировали несколько раз, удаляя неадгезированную фракцию клеток. Далее среду в лунках заменяли равным объемом (1 мл) полной питательной среды с цитокинами. Полная питательная среда состояла из 500 мл среды RPMI, 5 мл пирувата натрия (11 мг/мл), 146 мг глутамина, 50 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 3 мкл |3-меркаптоэтанола, 5 мл IOOx Antibiotic Antimycotic Solution (10,0 единиц пенициллина, 0,10 мг стрептомицина и 0,25 мкг амфотерецина В на мл Ix раствора), 20 нг/мл IL4 («ProSpec», США) и 20 нг/мл GM-CSF («ProSpec», США). Для стимуляции клеток добавляли негидролизуемый аналог аденозина - NECA («Sigma», США) в концентрации ЗОмкМ или 100 місМ и инкубировали в CCb - инкубаторе во влажной атмосфере 5% С02 при +37°С 24 или 72 часа соответственно. Для определения исследуемых параметров в отсутствии стимуляции (в качестве контроля) к клеткам добавляли растворитель NECA - диметилсульфоксид (DMSO). По завершении культивирования осуществляли пробоподготовку клеток для проведения иммунофенотипирования, ПЦР, а также сбор кондиционной среды для последующего определения концентрации цитокинов.
2.3.1.2