2.2. Материалы и методы исследования

Наблюдаемые беременные обследовались вне беременности в в течение всей беременности по следующей схеме: изучение анамнеза, общий осмотр, состояние органов и систем, данные объективного и акушерского исследований, показатели клинико-лабораторных иссле­дований .

Вне беременности у женщин изучали кольпоцитограммы, про­водили исследование по тестам функциональной диагностики, опре­деляли групповую и резус-принадлежность.

Определение продуктов перекисного окисления липидов

Концентрацию первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгат в плазме крови выявляли спектрофотометрическим методом по со­держанию гидроперекисей липидов в плазме крови (И.Д .Стальная, 1977; В.Б.І&врилов, М.И.Мишкорудная, 1903). Принцип метода ос­нован интенсивном поглощении диеновых структур гидропере­кисей липидов в области 232-234 нм. Результаты измерений выра­жали в относительных единицах оптической плотности.

Определение малонового диальдегида проводили по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой в модификации Э.Н.Коробей­никовой (1989). В основе метода лежит реакция между малоновым диальдегидом и тиобарбитуровой кислотой, протекающая с образо­ванием окрашенного триметикового комплекса. Оптическое погло­щение комплекса регистрировали на спектрофотометре СФ-І6 при длине волны 535-580 нм.

Определение скорости перекисного окисления липидов в бяомембраиах эритроцитов и в плазме крови проводили по методу

Е.А.Отроева, В.Г.Макорова (1986). Метод основан на определении конечных продуктов ПОД-малонового диальдегида, который при взаи­модействии с тиобарбатуровой кислотой образует окрашенный в ро­зовый цвет триметйновый комплекс, имеющий максимальное поглоще­ние при длине волны 580-582 нм. Измеряя экстинкцию полученных проб против контроля на спектрофотометре при 582 нм рассчитывали скорость образования в пробе МДА в присутствии прокосидантов (индуцированное перекисное окисление).

Содержание каталазы определяли с помощью метода спектро­фотометрического измерения активности этого фермента в биоло­гических жидкостях, предложенного М.А.Королюк и соавт. (1988). Принцип основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. Интенсивность ок­раски измеряли на спектрофотометра при длине волны 410 нм про­тив контрольной пробы, в которую вместо перекиси водорода вно­сили 2 мл воды.

Сульфгидрильные группы белка и небелковых соединений (об­щие группы) определяли с помощью фотокалориметрического улыра- микрометода (В.М.Фоломеев, 1981). Метод основан на эквивалент­ном взаимодействии иода со свободными сульфгидрильными группа­ми. 0 количестве их судили по количеству иода, взаимодейство­вавшего с тиогруппами, сравнивая опытную и контрольную пробы на фотоэлектрокалориметре.

йзследованяе гормонального статуса методом кольпоцитограмм

Метод функциональной диагностики основан на исследовании кольпоцитограмм. Он не потерял своей значимости ввиду простоты и доступности для любого лечебного учреждения (Е.й.ййатер,

1967; И.Д.Ариот, 1967 я др.). Возможность же его многократного проведения чрезвычайно важна для оценки в динамике изменений гормональных взаимоотношений в организме женщины.

При оценке цитологической картины вагинального мазка учи­тывались следующие особенности: вид клетки» размер в пределах своего слоя, характеристика протоплазмы, отношение ее и ядра к окраоке, преобладающий вид клеток, контурность клетки, характер расположения, интенсивность десквамация, наличие голых ядер, лейкоцитов, флора, слизь.

В течение беременности прослеживалась определенная динамика цитологических изменений, связанных со сроком беременности.

Для ранних сроков (период желтого тела) характерен в маз­ках тот гормональный фон, на котором наступает беременность, и цитограммы напоминают картину средней секреторной фазы менстру­ального цикла с преобладанием поверхностных и промежуточных клеток верхнего ряда.

По мере прогрессирования беременности желтое тело яичников увеличивает выработку прогестерона, что отражается в цитограм­мах снижением поверхностных клеток и промежуточных верхних ря­дов, составляющих половину клеточного состава мазка.

С появлением плаценты связана все возрастающая продукция \ прогестерона и наименее активных фракций эстрогенов, что отра­

жается в цитограммах дальнейшим снижением поверхностных и проме­жуточных клеток верхних рядов, составляющих уже 1/3 клеточного состава мазка. Преобладающим является собственно промежуточные клзтки.

После установления функции плаценты (с 20-й до Зб-й недели беременности) цитологическая картина становится стабильной с преобладанием собственно промежуточных клеток и минимальным

содержанием поверхностных и промежуточных клеток верхнего ряда. Период беременности 36-40 недель называется биологическим кон­цом беременности и характеризуется процессами старения плацен­ты и снижением продукции прогестерона, относительным повышени­ем содержания активных фракций эстрогенов.

При нормально протекающей беременности могут быть следую­щие типы кольпоцитограмм:

1} прогрессирующая беременность;

2) поздний срок беременности;

$) незадолго до сроков родов;

4) срок родов;

5) несомненный срок родов;

6) литический тип.

Материалом для исследования служило влагалищное отделяемое из передне-бокового свода. Забор материала производили легким касательным движением по стенке влагалища браншей пинцета и бережным нанесением на обезжиренное предметное стекло. Высуши­вали на воздухе и окрашивали гематоксилин-эозином или фуксином

Учитывая, что у 30-35$ женщин с невынашиванием выявляются эндокринные нарушения, связанные с гормональной дисфункцией плаценты - повышение эстрогенной активности или снижение обще- гормональной активности, мы применили классификацию цитологи­ческих изменений влагалищных мазков при эндокринном невынашива­нии, предложенную сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии ХЙУВ (Л.В.Снопковой, Т.М.Новаченко, А. Д. Исаевой, А.А.Тоцдяй,

В.В.Щербаковой, 1977, 1980). Согласно этой классификации, цитологические изменения влагалищных мазков были следующими:

I патологический цятотяп - повышение эстрогенной актив­ности (гиперэстрогенный тип),

ского гонадотропина в сыворотке крови проводили современным радиоиммунологичеоким методом о помощью китов фирмы "CfcЯ SORIH /франция- Италия/.

Кровь брали из вены /в объеме от 5 до 10 мл/ в утренние часы. После центрифугирования крови отделяли сыворотку, разли­вали на аликвоты, до проведения анализов замораживали при -15°С-20°С. В образцах сыворотки проводили одновременные иссле­дования нескольких гормонов.

Принцип метода основан на конкурентном взаимоотношении гормона, содержащегося в пробе, и гормона, меченного иодом - 125 за связь со специфическими антителами, количество которых ограничено. Комплекс "меченный антиген-антитело" отделяли от свободного меченного гормона и радиоактивность комплекса под­считывали на автоматических счетных установках.

До проведения радиоиммунологического анализа стероидные гормоны экстрагировали из 0,3 мл сыворотки крови женщин дважды перегнанным серным эфиром /3 мл/. После упаривания эфира 0,1-0,05 мл /в зависимости от срока беременнооти/ при определе­нии эстрадиола и 0,5 мл - прогестерона пробу в присутствии Н-3 одноименного гормона и антисыворотки инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°С, а затем - в течение 2 часов в ледяной бане при 4°С.

Разделение гормона, меченного ^SH, свободного и связанного с антителом, осуществляли углем, покрытым декстраном. Супер­натантную жидкость /0,5 мд/ переносили в склянки со сцинтил- ляционной жидкостью для определения радиоактивности.

Коэффициент экстракции эстрогенов и прогестерона в наших исследованиях равен 60-80$.

Настоящим методом определяются в крови неконъюгированные

формы эстрогенов.

Определение ХГ

Исследуемую сыворотку (0,1 мл) в соответствующем разведе­нии (1:1000 - для беременных) инкубировали с меченным иодом - 125 ХГ и антисывороткой в течение 18-20 часов при комнатной тем­пературе. Потом добавляли вторые антитела» фиксированные на цел­люлозе . Пробирки инкубировали при вращении на роторе в течение 5 часов при комнатной температуре.

После центрифугирования удаляли надосадочную жидкость, со­держащую свободную радиоактивность. Осадок промывали фосфатным буфером, содержащим 0,5% твин-20 и определяли связанную радио­активность.

Иммунологические методы исследования

Иммунологический статус оценивали на основании количествен­ного содержания и процентного соотношения Т- и В-лимфоцитов в периферической крови беременных; лимфоцитотоксических аллоанти- тел; гетерофильных гемолизинов.

При изучении количества Т-лимфоцитов в периферической крови женщин был использован метод спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е) по методу Jondai и соавт. (1972) в модификации С.А.Стеняной (1976). Лимфоцит считают розеткообра- зующей клеткой (РОК) в том случав, если на ее поверхности фикси­ровано не менее 3 чужеродных эритроцитов.

Содержание В-лимфоцитов исследовали в реакции розетко- образования в присутствии комплемента СЗ и сенсибилизированных

антителами эритроцитов.

Постановка реакции осуществлялась по методу Jondal (1972) в модификации Mendes (19*?3).

При оценке иммунного статуса нельзя ограничиваться только определением процентного содержания РОЛ, так оно оценивают лишь долю Т- и В-клеток среди остальных лимфоцитов. Абсолютное их содержание в I мл крови говорит о величине популяции иммуноком­петентных клеток, находящихся в циркуляции (Р.В.Петров и соавт., 1976).

В периферической крови беременных и небеременных женщин определяли общее количество лимфоцитов в I мкл. Зная процент­ное содержание РОЛ, вычисляем их абсолютное количество N в единице объема крови по формуле

^н “ ^ьюо¹ ' 1ГО ^гда

N- общее количество лейкоцитов в I мкл крови, і- процент­ное содержание лимфоцитов в формуле крови; г - процентное со­держание РОЛ.

Таким образом, в исследуемых образцах крови подсчитывали абсолютное количество лейкоцитов и лимфоцитов, относительное и абсолютное количество Т- и В-лимфоцитов.

Определение лймфоцйтотоксическйх аллоантител

При выполнений исследования использована модификация макротеста ivaskova и соавт.

Исходя из результатов обследования группы здоровых доноров,

критерием иммунности сывороток по лимфоцитотокоическим аллоан- тителам был принят процент окрашенных клеток более 15 (макси­мальный уровень антител в контроле), что соответствует интер­претации результатов макрометода другими авторами (В.Й.Говалло и соавт., 1974; Ivaskova и соавт., 1986). Этот показатель иммунности был использован при оценке лимфоцитотоксической ак­тивности сывороток беременных с невынашиванием.

Для постановки лимфоцитотоксической пробы необходима сыво­ротка беременной, лимфоциты мужа и 2-3 неродственных доноров, й» локтевой вены беременной женщины брали 5-7 мл крови в пробир ку. Лимфоцитарную взвесь получали на градиенте фиколл-кардяо- траст. Взятую у больной кровь разводили в два раза средой 199. І^адиент фиколл-кардиотраст готовили путем омешивания четырех частей 8$ раствора фиколла с одной частью 50$ кардиотраста. В пробирку со смесью фиколл-кардиотраст наслаивали кровь из рас­чета 2 мл на 1,5 мл смеси. Центрифугировали при 400-500g в течение 25-30 минут. Снимали слой лимфоцитов, ресуспендировали в среде 199 и трижды в этом растворе отмывали, центрифугируя каждый раз при 200 g в течение 10 минут. Осадок лимфоцитов ре- суспендировали в среде 199, концентрацию подсчитывали в камере Горяева.

Полученную лимфоцитарную смесь (0,03 мл) смешивали с 0,03 исследуемой сыворотки и инкубировали 30 минут при 37°С, после чего добавляли 0,03 мл комплемента (лиофиаязярованный препарат "комплемент морской свинки").

После инкубации в течение 1,5 часа при 37°С пробы прокраши вали. Вначале вносили 0,03 мл краски А⁺, разведенной перед упо­треблением дистиллированной водой в соотношении 1:10, а через 5-Ю минут - 0,06 мл краски В**. Подсчет прокрашенных клеток

осуществляли через 4-16 часов после введения красителя под микроскопом МБЙ-3 при увеличении Х900. Живые лимфоциты после окрашивания приобретают слабую голубую окраску, мертвые - ин­тенсивный иссиня-черный цвет. Выявление более 15% прокрашенных лимфоцитов в описанном варианте макротеста при контроле ниже 5% расценивается как проявление специфической аллосенсибилиза- ции беременной антителами плода, унаследованными от мужа. Конт­ролем служит неиммунная сыворотка или буферный раствор, в ка­честве которого могут быть использованы натрий-барбитоловый буфер ( Grofhaus а соавт., 1971), или раствор Кребо-Рингерфос- фат (ivaskova _й соавт., 1968), или раствор Ханкса, или среда 199, взятые для приготовления взвеси лимфоцитов, которые вводят ся в контрольную пробирку вместо сыворотки беременной.

Краска А-1,0 г эозина растворяли в 100 мл физиологического раствора (0,85% NaCX ). Перед употреблением этот основной раот вор смешивали с физиологическим раствором в соотношении 1:10.

⁺⁺Краска В-1,0 г метиленовой сини растворяли в 75 мл фи­зиологического раствора. 1,5 г марганцевокислого калия раство­ряли в таком же количестве физиологического раствора. Получен­ные растворы нагревали на водяной бане до 60°С. Затем марганец вливали в раствор метиленовой сини. Смесь фильтровали. В каче­стве красителя В использовали надосадочную жидкость.

Проводили прямой подсчет процента окрашенных клеток при большом увеличении (Х900), что считается наиболее точным из визуальных методов учета ( Etherdge , 1971). В этом преимуще­ство макротеста перед микрометодом при исследовании количества антител, хотя принципиальных отличий результатов этих двух тес­тов не наблюдается.

Уровень гетерофильных гемолизинов определяли по методике

Л.В.Антипвнской и соавт. (1985). По данным автора», количество указанных антител весьма точно отражает интенсивность транс­плантационных реакций при невынашивании беременности.

Методика определения антител, гемолизирующих эритроциты барана, состоит в следующем: к 0,03 мл исследуемой сыворотки добавляют 3 мл 2,5 стандартизированной взвеси эритроцитов барана, инкубируют I час при З^С, центрифугируют 10 минут при 2000 об/мин, определяют на ФЭКв оптическую плотность раствора при длине волны 400-450 нм о толщиной 5 мм. Величина коэффици­ента экстинций служит показателем количества гетерофильных гемо­лизинов .

Статистическая обработка результатов

Данные клинических наблюдений и показатели исследований подвергались статистической обработке. Группы сравнивались по методу Фишера-Стьюдента для связанных и несвязанных выборок. Вероятность случайных различий (Р) определялась по таблице Стьюдента с учетом числа степеней свободы варьирования. Оценку полученных значений проводили по двум порогам (95% и 99%), что соответствовало вероятности ошибки Р 0,005 и Р 0,001. Обработка данных проводилась на электронно-вычислительной машине “йбкра-226".