ФИКСАЦИЯ и ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА для ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО И ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ПОЧВООБИТАЮЩИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Л. ЛТ, Семенова

Методы исследования структур органов и тканей животных весьма разнообразны. Существует много руководств, где доста­точно подробно изложены методы анатомической и микроско­пической техники, т.

і Однако большинство методов гистологического исследова­ния разработано на тканях позвоночных животных.

В настоящей работе приведен обзор методов гистологиче­ского исследования тканей и органов беспозвоночных, главным образом, почвенных. Все эти методы являются модификациями ранее известных методов. Однако они разработаны с учетом морфологических особенностей почвенных беспозвоночных. В тех случаях, когда для исследования фиксируется целое жи­вотное, выбор способов и продолжительности фиксации опре­деляется характером склеротизации кутикулы, размером жи­вотного. Для препаровки беспозвоночных используются препа­ровальные иглы, тонкие хирургические ножницы, тонкие пин- цеты.

Лучшими фиксирующими смесями являются следующие; жидкости Буэна, Ценкера, Карнуа, Шабадаша (Ромейс, 1953; Роскин, Левинсон, 1957; Касили, 1962). Эти смеси быстро про­никают в ткани и могут быть рекомендованы как для обзорных препаратов, так и для тонких исследований.

Для приготовления жидкости Буэна нужно смешать 15 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты с 5 мл формалина и 1 мл ледяной уксусной кислоты. Продолжитель­ность фиксации материалов в этой жидкости в зависимости от размеров объекта — от двух до нескольких суток. После фикса­ции материал переносят в 70°-ный спирт, который несколько раз оменяют, до полной отмывки фиксатора, т. е. до (Исчезнове­ния желтой окраски.

Жидкость Ценкера готовят из расчета: 5 г сулемы, 2,5 г двухромовокислого калия, 1 г сернокислого натрия на 100 мл дистиллированной воды.

241

в проточной воде в течение суток для полного удаления из объ­екта двухромовокислого калия. Затем объект переносится в 70°-ный спирт, к которому добавляют капли спиртового раство­ра иода (до приобретения раствором цвета коньяка), и ставят в темное место. Постепенно спирт обесцвечивается и к нему до­бавляют новые порции иода. Добавление иода повторяют до тех пор, пока обесцвечивание спирта полностью не прекратит­ся. После этого объекта отмывают в нескольких порциях 70°- ного спирта в течение 2—3 суток, до полного удаления иода. Иодирование материала проводят для удаления сулемы, кри­сталлы которой могут искажать окраску и затруднять рассмот­рение препарата.

Хорошие результаты исследований получаются после фи­ксации объектов в жидкости Карнуа. Эту жидкость составляют из расчета: 60 мл абсолютного спирта, 30 мл хлороформа и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Эта фиксирующая смесь очень быстро проникает в ткани. Объекты диаметром в 2 мм оказы­ваются зафиксированными уже через час, а при толщине 5 мм— через 4—5 час. После фиксации объект переносят в абсолют­ный спирт.

Фиксирующая смесь Шабадаша состоит из 100 мл 96°-ного спирта, 1,8 г азотнокислой меди, 0,9 г азотнокислого кальция и 10 мл 40%-ного формалина. Объекты толщиной до 5 мм фикси­руются в течение трех часов. Зафиксированный материал про­мывают, несколько раз сменяя 96°-ный спирт, в течение 6—12 час.

Объекты исследования, предназначенные для заливки в па­рафин, после отмывки фиксирующей жйдкости следует обезво­дить. Обезвоживание осуществляется постепенно, путем пере­носа из слабых спиртов в крепкие. Исключение составляют объекты, фиксированные в смесях Карнуа и Шабадаша, кото­рые сразу переносят в абсолютный спирт. Обычно достаточно провести объекты после отмывки фиксаторов через 2—3 порции 70°-иого спирта, одной порции 80°-ного и 2 порции 96°-ного.

Обезвоживание объектов в абсолютном спирте (две порции) нужно производить в течение 12—15 час.: при передержке ткани становятся твердыми и ломкими. Затем объекты переносятся в смесь, состоящую из равных частей 100°-ного спирта и ксилола, на 2—3 часа, в чистый ксилол на 30—60 мин. и, наконец, в смесь равных частей расплавленного парафина и ксилола в термо­стате при 37°. Отдельные органы в этой смеси достаточно дер- 242

жать 1,5—2 часа, а крупные участки тела или целое живот­ное— до 4 час. Затем объекты переносят в чистый расплавлен­ный парафин, находящийся в термостате при 60^е. Желательно иметь две смены парафина. В парафине мелкие объекты доста­точно держать по 1 часу в каждой порции, а крупные — по 1,5 часа.

При обезвоживании абсолютный спирт может быть заменен метилбензоатом. Материал после выдерживания в 2—3 порци­ях 96^в-ного спирта переносят в метилбензоат. Єрок выдержива­ния в метилбензоате не ограничен, материал может даже хра­ниться в нем, так как ткани не сжимаются. Из объектов, зали­тых в парафин, приготовляют срезы. Для обзорных препаратов пригодны срезы толщиной 10 мк, для исследования клеточных структур необходимы срезы в 6—7 и меньше микрон. Ленточки срезов помещают в дистиллированную воду, налитую на пред­метные стекла, смазанные яичным белком. Стекла со срезами помещают на подогреваемый до 40° столик для расправления гистологических препаратов, затем удаляют фильтром излишек воды и переносят стекла для подсушивания в термостат при 37°

Обзорные препараты окрашиваются различными смесями с гематоксилином или по методу Маллори в различных его моди­фикациях.

Железный гематоксилин готовят следующим образом. 0,5 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96^в-ного спирта и разбавля­ют 90 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в открытой колбе в течение 4—5 недель. Перед употреблением раствор фильтруют и разбавляют равным количеством дистиллирован­ной воды. Перед окраской железным гематоксилином срезы, освобожденные от парафина, необходимо обработать раствором железных квасцов (10 г светло-фиолетовых кристаллов желез­ных квасцов на 100 см³ дистиллированной воды). Препараты выдерживаются в растворе железных квасцов 3—6 час., после чего ~их споласкивают дистиллированной водой и переносят в-раствор железного гематоксилина на 1—5 час. Затем стекла со срезами вынимают, ополаскивают дистиллированной водой и снова помещают в раствбр железных квасцов для дифферен­цировки. Степень дифференцировки контролируют, время от времени вынимая препараты и рассматривая их под микроско­пом. При окраске железным гематоксилином хорошо выявля­ются внутриклеточные структуры (хроматин, ядрышки, грану­лы, митохондрии).

Для приготовления кислого гемалауна по Майеру 1 г гема­токсилина раствбряют в 1000 мл дистиллированной воды, пои- бавляют 0,2 г иодноватокислого натрия (NaIO_s) и 50 г химически чистых калийных квасцов. После полного растворения солей к раствору добавляют 50 г хлоральгидрата и 1 г кристаллической

9*

243 лимонной 'кислоты. Раствор сразу Готов к употреблению. Пре­параты, освобожденные от парафина, из дистиллированной во­ды помещают в краску ,на 10—15 мин., затем промывают в проточной воде. В результате окраски ядра клеток становят­ся ярко-синими, хорошо различимы границы клеток, клеточные включения окрашиваются в серовато-синий цвет.

Окраску по Маллори проводят следующим образом. Срезы помещаются в 0,1 %-ный водный раствор кислого фуксина на 3 мин., промывают в воде, после чего переносятся в 1 %-ный ра­створ фосфорномолибденовой кислоты на 5 мин.Затем препараты снова промывают в воде и помещают на 2 мин.

Азановый метод по Гайденгайну является модификацией метода Маллори, дающей более четкое и красивое окрашивание препаратов. Особенно пригоден этот метод для окраски покро­вов беспозвоночных, поскольку дает дифференцированное окра­шивание их слоев. Эта окраска лучше всего удается после фик­сации объектов жидкостью Ценкера.

Препараты, освобожденные от парафина, помещают в рас­творе азокармина (0,1 г азокармина растворяют в 100 мл ди­стиллированной воды, кипятят, охлаждают, фильтруют и добав­ляют 1 мл ледяной уксусной кислоты) в термостат при темпе­ратуре 56° на 20 мин., затем при комнатной температуре спо­ласкивают дистиллированной водой, дифференцируют в спирто­вом анилиновом растворе (1 см³ анилинового масла на 1 л 90°- ного спирта). Дифференцируют до тех пор, пока не выступят отчетливо ядра клеток. Препарат быстро споласкивают уксус­нокислым спиртом (1 мл ледяной уксусной кислоты на 100 мл 96°-ного спирта). Затем препараты протравливают в течение

1 часа в' 5%-ном растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты, ополаскивают дистиллированной водой и окрашивают в анили­новом сине-оранжевом — уксусной кислоте. Для приготов­ления этого красителя растворяют 0,5 г анилинового синего и

2 г оранжевого золотого в 100 мл воды и приливают 8 мл ледя­ной уксусной кислоты. Раствор кипятят и разбавляют трехкрат­ным количеством дистиллированной воды. После окраски пре­параты дифференцируют 96°-ным спиртом, последовательно проводят по спиртам, возрастающей концентрации, включая абсолютный спирт, промывают в ксилоле и заключают в баль­зам. Соединительные ткани этим методом окрашиваются в си­ний цвет, хроматин — в красный, мышечная ткань — в розовый, слизистое вещество — в голубой.

244

гиподерма имеет фиолетовый цвет, эндокутикула — ярко-голу­бой, экзокутикула — красный.

При изготовлении гистологических препаратов целых жи­вотных, имеющих твердые покровы, необходимо предварительно размягчить кутикулу раствором диафанола. Раствор диафанола представляет собой 50%-ную укусную кислоту, насыщенную на льду парами двуокиси хлора. Эту смесь нужно хранить в про­хладном темном месте в стеклянной посуде с притертой проб­кой (с диафанолом необходимо работать под тягой, так какой ядовит). Фиксированный материал ополаскивают 63%-ным раствором спирта и заливают диафанолом. Диафанол с нахо­дящимся в нем объектом выставляют на дневной свет, пока кути­кула не побелеет и не размягчится. После размягчения покро­вов объект промывают в 63%-ном спирте и затем подвергают дальнейшему обезвоживанию и заливке.

Для изучения морфологического строения таких беспозво­ночных, как мокрицы, кивсяки, личинки мух-львинок, в покро­ва^ которых есть включения углекислого кальция, необходимо в качестве фиксирующих смесей применять такие, которые со­держат уксусную кислоту. Это — жидкости Буэна, Ценкера, причем количество ледяной уксусной кислоты в этих смесях не­обходимо удвоить в сравнении с обычно применяемым.

Изучение микроскопического строения покровов животных, имеющих мягкую кутикулу, не представляет трудностей. Иссле­дование строения покровов беспозвоночных с твердой кутику­лой очень затруднительно. Диафанол в этом случае употреб­лять нельзя, так как он разрушает структуру кутикулы. Совер­шенно недопустимо и обезвоживание объектов после фиксации с помощью абсолютного спирта и в его смеси -с ксилолом. Ку­тикула в этом случае всегда крошится под ножом микротома.

Лучше всего йбезвоживать объект в метилбензоате. Про­цесс обезвоживания протекает очень медленно, не меньше не­дели даже в случае небольших размеров объекта: После мети- лбензоата в парафине при температуре 56° объекты должны находиться ,не менее 5—6 час. Желательно также, чтобы у иссле­дуемых объектов были удалены голова, конечности и хвосто­вая часть тела. Продольные тотальные срезы через все тело животных с твердой кутикулой удается сделать только в слу­чае очень маленьких объектов. Более крупных животных не­обходимо предварительно разрезать на части. Не рекоменду­ется дл'я исследования кутикулы вырезать участок покровов, так как кутикула в этом случае крошится под ножом. Срезы лучше всего удаются, если кутикула не нарушена и все внут­ренние органы сохранены.

При изготовлении гистологических препаратов из целых беспозвоночных большой помехой может оказаться содержимое кишечника. Дождевых червей, обитающих в толще почвенного слоя, перед фиксацией следует на 2 суток поместить в чашку

245

Петрй на влажную ткань или фильтровальную бумагу. За это время кишечник освобождается от песчинок и червь может быть зафйксирован целиком или отдельными частями. С неопо- рожненными кишечниками можно фиксировать только некото­рых поверхностно живущих червей, как, например, Eisenia foe­tida, Dendrobaena octaedra, Eiseniella tetraedra, в кишечниках которых, как правило, нет песчинок.

У многих личинок насекомых-ксилофагов в ^период их ак­тивного питания кишечник заполнен крупными частичками древесины, что очень мешает изучению микроскопического строения их тела, и, в частности, кишечного тракта. В этом слу­чае приходится отпрепаровывать кишечник, разрезать его на части и удалять пищевую массу. Кусочки тела без кишечни­ка и отдельные части кишечника можно затем фиксировать лю­бой предложенной фиксирующей смесью.

Для выявления различных включений в цитоплазме предло­жен ряд гистохимических методов.

Одним из важнейших клеточных включений у беспозвоноч­ных является гликоген. Выявление гликогена производится на парафиновых срезах. Оно основано на применении реактива Шиффа с предварительной обработкой препаратов йодной кис­лотой или перйодатом калия (КЮ₄) (Шабадаш, 1947). Обра­ботка препаратов реактивом Шиффа производится следующим образом. Препараты, освобожденные от парафина и доведен­ные до дистиллированной воды, помещают на 15 мин. в 0.01 М раствор перйодата калия (0,115 г КЮ₄+50 мл бидистиллиро- ванной воды). Затем их споласкивают в трех порциях дистил­лированной воды н помещают на 20 мин. в реактив Шиффа. Реактив Шиффа готовят следующим образом: 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл кипящей воды, охлаждают до 50° и прибавляют 20 мл 1н соляной кислоты, затем охлаждают смесь до 25® и добавляют 1 г сухого бисульфата натрия (NaHSOa). Полученный реактив сливают в темную стеклянную посуду с притертой пробкой и хранят в темноте (через несколь­ко часов жидкость обесцвечивается). После окраски в реакти­ве Шиффа препараты промывают в трех сменах сернистой воды (200 мл дистиллированной воды, 10 мл 10%-ного раствора би­сульфата натрия и 10 мл одионормальной соляной кислоты) Затем препараты промывают водой и докрашивают кислым ге- малауном по Майеру. В результате такой обработки гликоген окрашивается в ярко-малиновый цвет.

Для выявления жира в клетках особенно удобно применять раствор краски Судана III. 1 г Судана III растворяют в 100 мл абсолютного спирта, полученный раствор кипятят и профильт­ровывают. Охлажденный раствор готов к употреблению. Для выявления жира кусочки органов или тканей животных поме­щают на 3—4 часа в 10— 12%-ный формалин, затем промывают водой и делают срезы на замораживающем микротоме. Этот

246

способ можно упростить при работе с такими тканями, как жи­ровая у членистоногих или хлорагогенная у дождевых червей. В этом случае небольшой кусочек этой ткани кладут на пред­метное стекло, а другим предметным стеклом, слегка нажимая на кусочек ткани, делают мазок. В таком мазке сохраняются отдельные клетки и группы клеток. Стекло с мазком помещают в 15%-ный формалин на 5 мин., ополаскивают водой и погру­жают в раствор Судана III на 1 аде. После окраски препарат переносят в дистиллированную воду и заключают в глицерин. Жир окрашивается в черно-синий цвет (Семенова, 1967, 1972).

Для выявления мочевой кислоты в клетках применяется ме­тод Кумона — Андре, видоизмененный Голландом (Глик, 1950). Материал фиксируют смесью, содержащей азотнокислое сереб­ро и нейтральный формалин. Непосредственно перед употреб­лением смешивают равные объемы 1%-ного раствора AgNO₃ и 4%-ного формалина (нейтрализованного углекислым кальци­ем). Исследуемый орган или кусочек ткани фиксируют 12— 24 часа в этой смеси в темноте. Затем материал промывают в не­скольких порциях дистиллированной воды в течение 24 час. Обезвоживание и заливка в парафин проводится обычным спо­собом. Срезы впоследствии можно докрасить гемалауном в те­чение 10 мин., после чего промыть в проточной воде в течение часа. В результате такой обработки ядра окрашиваются в яр­ко-синий цвет, плазма — в серовато-голубой, ураты приобрета­ют черную окраску.