БИОХИМИЧЕСКАЯ СИСТЕМАТИКА

Отечественными биохимиками А.Н. Белозерским, А.С. Спириным, А.С. Антоновым и их пос­ледователями в начале 1970-х гг. XX в. были сформулирова­ны представления об использовании генетических и биохими­ческих показателей в оценке таксономического сходства живых организмов («Строение ДНК и положение организмов в систе­ме», 1972), ныне получившие широкое распространение.

Со времен Эрнста Геккеля (1834-1919) известна триада сравнительно-филогенетических методов: морфологического, эмбриологического и палеонтологического. Исследователь, ра­ботающий классическими методами, сначала изучает морфо­логию и анатомию интересующих его объектов. Если черты строения органов, тканей и клеток не позволяют отнести их с достаточной уверенностью к тому или другому таксону, на помощь приходит эмбриология. В развитии организмов неред­ко сохраняются черты их отдаленных предков. Морфологичес­кие и эмбриологические данные там, где это возможно, допол­няются палеонтологическими.

Комбинация этих методов — весьма мощный инструмент систематика-эволюциониста. Однако классические методы

42

УРОВНИ БИОРАЗНООБРАЗИЯ

пасуют именно в применении к низшим организмам. Морфо­логические признаки примитивных организмов за время их эволюции могли неузнаваемо измениться или, наоборот, дать многочисленные примеры конвергенции, а также параллель­ного развития. Кроме того, примитивные организмы именно в силу их примитивности, мало пригодны для изучения мор­фологии. Формы большинства бактерий (палочка, шарик, спи­раль) могли возникнуть самостоятельно в разных группах и многократно перейти друг в друга независимо на разных пу­тях эволюции. То же относится к эмбриологическому методу: можем ли мы назвать «онтогенезом» деление бактериальной клетки или самосборку вирусной частицы? Палеонтологичес­кий метод также неприменим там, где речь идет об однокле­точных бесскелетных организмах: они практически не сохра­няются в окаменевшем состоянии.

Для понимания степени филогенетического родства орга­низмов неоднократно использовались данные о составе и свой­ствах их алкалоидов, жиров, белков, путях синтеза тех или иных метаболитов. Широко известны также попытки приме­нения иммунобиологических и иммунохимических методов, а также анализа элементного состава (Лебедева, 1999).

Однако подобные исследования имели весьма ограничен­ный успех и не получили признания у «классических» систе­матиков. Дело здесь не в консерватизме систематиков. При­менявшиеся биохимические показатели были так же вторич­ны, как и морфологические. В конечном счете нет разницы между, допустим, числом щетинок у рачка и числом изози- мов его лактатдегидрогеназы — обе величины суть признаки фенотипа, а не генотипа.

По мнению А.Н. Белозерского и его учеников, переворот в биохимической систематике произошел после того, как аме­риканский ученый Э. Чаргафф в самом начале 1950-х гг. со­вершил открытие кардинальной важности, установив, что нуклеиновые кислоты, так же как и белки, видоспецифичны. На протяжении последующих 20 лет были получены данные, неопровержимо доказывающие, что нуклеиновые кислоты — не только материальная форма хранения наследственной ин-

43

ГЛАВА I

формации, но и те соединения, через которые осуществляется реализация наследственности в процессах развития организ­ма. Крайне перспективно изучение нуклеиновых кислот с точ­ки зрения познания основ эволюционного процесса — наслед­ственности и изменчивости.

В первую очередь речь должна идти о дезоксирибонукле­иновой кислоте — ДНК, так как именно это соединение явля­ется материальным субстратом наследственности подавляю­щего большинства организмов (за исключением РНК-содер- жащих вирусов). В течение более 15 лет была проведена огромная работа по изучению первичной структуры ДНК раз­личных бактерий, актиномицетов, грибов, водорослей, выс­ших растений, а также позвоночных и беспозвоночных жи­вотных.

1. Сумма пуриновых нуклеотидов равна сумме пирими­диновых нуклеотидов:

2. Содержание аденина равно содержанию тимина:

3. Содержание гуанина равно содержанию цитозина:

4. Содержание 6-аминогрупп равно содержанию 6-кето- групп:

44

УРОВНИ БИОРАЗНООБРАЗИЯ

Г»

5. Содержание Г+Ц и А+Т может варьировать в довольно значительных пределах.

Поэтому для ДНК наряду с единым планом строения, обус­ловленным ее жесткой двуспиральной структурой, присуща возможность бесконечного варьирования состава и последова­тельности оснований.

Несомненно, возникновение ДНК в процессе происхожде­ния жизни на Земле было важнейшим фактором диффе­ренциации и становления новых видов. В структуре ДНК на­следственная информация не только сохраняется наилучшим образом, но и может передаваться путем репликации от поколе­ния к поколению. В бесконечной цепи следующих друг за дру­гом поколений естественным отбором были выбраны структуры ДНК, обеспечивавшие не только стабильность наследственной информации (консерватизм наследственности), но и возможность вариации первичной структуры ее макромолекулы.

Из пятого правила Чаргаффа вытекает второй, не менее важный вывод, сделанный одновременно и независимо друг от друга А.Н. Белозерским и А.С. Спириным и французски­ми исследователями Ли, Валь и Барбю, а именно: процент пар гуанин—цитозин, изменяющийся в процессе эволюции, видо­специфичен и может иметь таксономическое значение. Впер­вые это было показано на ДНК бактерий, где мы имеем очень большие вариации нуклеотидного состава. Показатель

у бактерий может меняться от 2,57 (сарцина) до 0,45 (воз­будитель газовой гангрены). Если этот показатель равен 1 (Г+Ц=А+Т=50%), такую ДНК называют эквимолярной. В ДНК ГЦ-типа гуанина и цитозина более 50%, для ДНК АТ- типа характерно обратное соотношение оснований.

Впоследствии вариабельность нуклеотидного состава ДНК была изучена у многих групп водорослей, грибов, вирусов, а также высших растений и животных. Анализируя эти дан­ные, А.С. Антонов пришел к выводу о том, что вариабельность соответствует эволюционному возрасту таксона. Древние груп­пы (вирусы, бактерии, грибы, водоросли) очень варьируют по составу ДНК. То же отмечается и у животных. Так, например, у древнейшей группы простейших содержание Г+Ц может ме­няться почти на 39%, у губок эта величина уже 25%, у хордо­вых— менее 6%.

45

ГЛАВА I

Не исключена возможность, что значительная вариабель­ность нуклеотидного состава ДНК микроорганизмов свиде­тельствует об их полифилии; в то же время она может быть лишь следствием длительности мутационного процесса. Лю­бопытно, что ДНК практически всех высших растений и жи­вотных АТ-типа, причем нуклеотидный состав довольно ста­билен. Специфичность в данном случае реализуется по линии нуклеотидной последовательности. Это обстоятельство огра­ничивает применение такого показателя, как нуклеотидный состав ДНК, у высших организмов. Тем не менее, использова­ние данных о составе ДНК позволяет сделать более обоснован­ный выбор из числа имеющихся альтернативных схем макро­филогенеза.

А.С. Антоновым и Б.М. Медниковым (1972) методами ва­риационной статистики был проанализирован материал о составе ДНК около 2000 видов различных организмов. Из полученных данных сделан ряд любопытных выводов. Преж­де всего можно заключить, что выделенные ранее формаль­ные категории ДНК — ГЦ- и АТ-типа — не субъективны, а отражают реально существующую в природе закономерность: во всех наиболее изученных группах чаще всего встречаются ДНК, содержащие от 35 до 45 или от 50 до 60 мол.% ГЦ-пар нуклеотидов. Иными словами, мы имеем два модальных клас­са. Первый модальный класс (АТ-тип ДНК) прослеживает­ся в группах хордовых и беспозвоночных животных, выс­ших растений, грибов, сине-зеленых водорослей, бактерий и вирусов. ДНК второго модального класса (ГЦ-тип ДНК) отмечена у грибов, актиномицетов, водорослей, бактерий и вирусов. Самое удивительное то, что эквимолярный состав ДНК встречается относительно редко. Этот факт загадочен, так как ДНК с равным количеством всех четырех оснований должна обладать максимально возможной информационной емкостью (два бита на нуклеотид, согласно уравнению Шен­нона).

Биохимики разработали методы сравнения организмов по набору аминокислот, а также по прямому сопоставлению мо­лекул ДНК.

Второй подход сравнения последовательностей в ДНК бо­лее перспективен. Это так называемый метод молекулярной гибридизации. За последние годы он получил широкую из­вестность среди микробиологов. Можно утверждать, что пер-

46

УРОВНИ БИОРАЗНООБРАЗИЯ

вые успешные попытки создать филогенетическую систему вирусов и бактерий основаны главным образом на примене­нии этого метода.

Метод молекулярной гибридизации был разработан в США Хойером, Мак-Карти и Болтоном. Принцип метода сравни­тельно несложен. Как известно, нативная ДНК состоит из двух комплементарных цепей, соединенных водородными связями между аденином и тимином, и гуанином, и цитозином. В нор­мальных условиях клетки эта структура весьма устойчива. Если же повысить температуру, особенно в условиях низкой ионной силы, водородные связи между комплементарными цепями рвутся: ДНК денатурирует.

Если денатурированную ДНК иммобилизировать осаж­дением на целлюлозный фильтр или включением в агаро­вый либо полиакриламидный гель, ренатурации не произой­дет. Работая одним из основных методов, процесс гибриди­зации проводят в колонке с гелем, в который «вплавлена» денатурированная ДНК. Затем через колонку пропускают раствор ДНК, также денатурированной, но, кроме того, под­вергнутой деградации (молекулы ДНК легко разрываются на части; этот процесс называют деградацией и обычно в ка­честве деградирующего агента применяют ультразвук). Короткие фрагменты деградированной ДНК легко проходят через поры геля и могут соединяться с иммобилизирован­ной ДНК, образуя реассоциированные двойные цепи. Низ­комолекулярную ДНК обычно метят радиоактивным фос­фором, углеродом или тритием. В дальнейшем надо лишь вымыть из колонки неприсоединившуюся меченую ДНК. Весьма полезен прием, заключающийся в обработке препа­рата специфической ДНК-азой, расщепляющей одноцепо­чечную ДНК, но не трогающей двухцепочечную. В резуль­тате в геле остаются только гибридные цепи (в тех случаях, когда ДНК иммобилизированная и меченая происходят из разных источников). О проценте гибридизации мы можем судить по активности конечного продукта.

47

ГЛАВА I

Болтон и Мак-Карти прекрасно отдавали себе отчет в том, насколько разработанный метод может быть цепным именно для систематики. В конечном счете это прямое определение близости геномов друг к другу. По ряду причин методу моле­кулярной гибридизации «нестрашны» конвергенция и парал­лельное развитие — проклятие всех ныне существующих ме­тодов определения сходства организмов. Например, вполне вероятно конвергентное развитие макроструктур у неродствен­ных форм. Весьма часто и конвергентное возникновение сход­ных по функции белков: лизоцимы фагов и высших орга­низмов, несомненно, не родственны. Однако конвергентное возникновение идентичных аминокислотных последователь­ностей уже крайне маловероятно. Еще менее вероятно подоб­ное возникновение идентичных участков цепей ДНК, даже если они кодируют сходные по составу белки. Ведь генетичес­кий код вырожден и большинству аминокислот может соот­ветствовать несколько триплетов. Поэтому молекулярная гиб­ридизация — весьма многообещающий метод для выявления полифилетических таксонов.

Даже в столь хорошо изученной группировке, как мле­копитающие, этим методом подтверждена полифилия отря­да грызунов, многими систематиками давно разделяемого на отряды зайцеобразных и двурезцовых. Известно, что дис­кутируется вопрос о разделении на самостоятельные отря­ды зубатых и беззубых китов, а также ластоногих и насеко­моядных.

Однако возникли не только технические, но и методи­ческие трудности. Уже первые работы по гибридизации ДНК показали, что у высших организмов геном неоднороден. В самом первом приближении его можно разделить на две фракции: фракция уникальных последовательностей и фрак­ция повторяющихся последовательностей. Не менее инте­ресны сателлитные-фракции ДНК — оказалось, что кон­центрации их варьируют очень сильно даже у близкород­ственных видов.

Комбинируя условия выделения, фракционирования и гибридизации ДНК, в принципе можно сопоставлять геномы в пределах таксонов любого ранга, вплоть до вида и в конеч­ном счете весьма облегчить работу систематика, предоставив ему уникальные данные биохимического анализа. Методика молекулярной гибридизации, хотя и не представляет собой

48

УРОВНИ БИОРАЗНООБРАЗИЯ

ничего сложного, чрезмерно трудоемка. Обнадеживает то, что она поддается автоматизации, а в ряде лабораторий США и Западной Европы поставлена «на поток», стала рутинной про­цедурой, хотя и довольно дорогостоящей.

Впрочем, уже достаточно давно метод молекулярной гиб­ридизации в сочетании с определением нуклеотидного соста­ва и анализом изоплит дает результаты и не только при решении частных проблем систематики. Так, группой А.С. Антонова были проведены опыты по изучению степени гомологичности пер­вичных структур геномов у однодольных растений и разных классов хордовых животных (главным образом птиц, репти­лий). Следует остановиться на одном выводе из серии этих работ, имеющем для построения систем принципиальное зна­чение.

Речь идет о разномасштабности таксонов в пределах различных групп растительного и животного мира. Известно, что все системы построены по иерархическому принципу: виды объединяются в роды, роды в семейства, семейства в от­ряды (или порядки в фитосистематике) и т. д., вплоть до царств живой природы. Возникает вопрос: соответствует ли род, например, однодольных растений роду птиц или млекопита­ющих? Ответить на этот вопрос трудно, так как если границы таксона систематики обычно очерчивают правильно, то ранг присваивается довольно произвольно и имеет тенденцию по­вышаться в связи с изученностью группы. Ясно, однако, что если таксоны равномасштабны, то и степень гомологичности первичных структур ДНК у образующих их видов должна быть одинаковой.

Однако первые опыты по гибридизации ДНК показали дру­гое — разномасштабность таксонов в системах разных групп растительного и животного мира. Так, например, меченая ДНК домашней курицы имеет приблизительно 25—38% го­мологичных последовательностей с ДНК птиц других отрядов (исследовались воробьиные, трубконосые, попугаи, голуби и дневные хищники). Приблизительно Такая же межотрядная степень гомологии ДНК установлена Мак-Карти и Болтоном для класса млекопитающих. Степень гомологичности после­довательностей в ДНК представителей разных классов позво­ночных, естественно, ниже (у ДНК курицы и варана, напри­мер, 10,5%). Эти участки генома, по всей вероятности, коди­руют наиболее общие признаки, присущие всем хордовым.

49

ГЛАВА I

Совсем другие цифры получены для однодольных расте­ний. Виды, относимые к разным семействам порядка лилие­цветных, имеют лишь до 10% гомологичных структур ДНК. Иными словами, семейство в группе однодольных растений по рангу должно быть приравнено к классу хордовых жи­вотных! Представители разных порядков однодольных об­ладают еще более гетерологичной ДНК, а между ДНК одно­дольных и двудольных растений иногда вообще не образуется гибридных молекул. О субъективности ранга систематичес­ких категорий говорилось уже неоднократно, но теперь мы можем количественно оценить, насколько велика эта субъек­тивность. Во всяком случае эти данные свидетельствуют о различиях кардинального свойства в путях и темпах эволю­ции геномов.