ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
Регенеративная медицина является новым направлением, базирующимся на инновационных подходах к терапии болезней. Широкие возможности применения клеточных технологий в области регенеративной медицины делают их основой для разработки подходов к терапии ожоговых ран.
Наиболее перспективным направлением в лечении ожогов с использованием клеточных технологий на данный момент является применение стволовых клеток [100, 194, 234]. Однако, несмотря на доказанный положительный эффект, терапия стволовыми клетками, во- первых, не является безопасной для всех пациентов, в том числе из-за риска онкологических осложнений [220]. Во-вторых, выделение и культивирование стволовых клеток - трудоемкий и дорогостоящий процесс. В-третьих, проблемой остается отсутствие правовой базы применения стволовых клеток.Поскольку внедрение терапии стволовыми клетками в широкую клиническую практику на данный момент достаточно проблематично, разработка альтернативных способов лечения ожогов вызывает особый интерес. Одним из возможных путей решения данной проблемы является поиск клеток с механизмом действия, сходным со стволовыми клетками. Существует все больше доказательств в пользу гипотезы о том, что регенеративный эффект стволовых клеток обусловлен секрецией широкого спектра цитокинов [125, 160, 202], которые, в то же время, не являются уникальными и вырабатываются, хотя и в меньшей степени, также дифференцированными клетками периферической крови. Следует отметить, что последние, в отличие от стволовых, не обладают онкогенной активностью. Так, например, широким спектром секретируемых цитокинов обладают моноциты [155, 182]. Их легко выделить из крови человека в количестве, достаточном для культивирования и последующей аутологической трансплантации.
Так как уровень секреции цитокинов моноцитами недостаточно высок, целесообразным является исследование путей и механизмов, позволяющих изменять их экспрессионную и секреторную активность.
В ряде исследований было продемонстрировано, что эндогенный пуриновый нуклеотид аденозин способен стимулировать продукцию цитокинов различными клетками, в том числе моноцитами [16, 53, 54]. Поэтому изучение роли модифицированных аденозином моноцитов в репаративной регенерации кожи при ожоговой травме представляется весьма актуальным. Научной концепцией настоящего исследования является предположение о том, что модифицированные аналогом аденозина 5’-N- этилкарбоксамидоаденозином (NECA) моноциты будут обладать измененным цитокиновым профилем, вследствие чего стимулировать регенеративные процессы в поврежденной ткани на модели ожоговой раны.Степень разработанности темы исследования. Большое количество исследований посвящено изучению роли аденозина как участника важных физиологических и патологических процессов организма (ангиогенез, воспаление, канцерогенез и т.д.) [16, 21, 36, 48, 49, 74, 94, 98, 103, 209, 216]. Однако как в отечественной, так и в зарубежной литературе не рассматривалась возможность использования модифицированных аденозином клеток в области регенеративной медицины.
Цель исследования: установить роль модифицированных аденозином моноцитов в репаративной регенерации кожи при ожоговой травме.
Задачи исследования:
1. Определить иммунофенотипический профиль стимулированных и нестимулированных аденозином моноцитов.
2. Определить уровень экспрессии мРНК 4 типов аденозиновых рецепторов стимулированными и нестимулированными аденозином моноцитами.
3. Определить цитокиновый профиль стимулированных и нестимулированных аденозином моноцитов.
4. Осуществить экспериментальную оценку регенеративного потенциала модифицированных клеток in vivo на модели ожоговой раны.
Научная новизна
Впервые дана сравнительная характеристика влияния различных режимов стимуляции моноцитов аналогом аденозина NECA на иммунофенотипический и цитокиновый профиль моноцитов. Получены новые данные о влиянии NECA на экспрессию поверхностных маркеров моноцитов и дендритных клеток (CDla, CD14, CD209).
Установлено, что добавление аналога аденозина в культуральную среду приводит к увеличению экспрессии иммунофенотипического маркера моноцитов CD 14, снижению экспрессии маркера незрелых дендритных клеток CDla. Экспрессия маркера зрелых дендритных клеток CD209 возрастает либо остается неизменной в зависимости от режима стимуляции аналогом аденозина. Выявлено значительное количество клеток с иммунофенотипом CDla'CD14+CD209+ при культивировании моноцитов с NECA.Впервые продемонстрировано изменение экспрессии мРНК генов аденозиновых рецепторов при различных режимах стимуляции моноцитов NECA. В частности установлено, что мРНК генов Al и А2В аденозиновых рецепторов вне зависимости от стимуляции экспрессируется с одинаковой частотой, а уровень экспрессии A2A и АЗ рецепторов повышается при стимуляции NECA.
В данной работе впервые изучено влияние различных режимов стимуляции NECA на экспрессию мРНК генов цитокинов моноцитов (IL1 В,
IL6, IL8, ILlO5 IPlO5 FGFB5 VEGF5 TGFB) и концентрацию цитокинов в кондиционной среде (IL-Ip5 IL-6, IL-8, IL-IO5 IP-IO5 PFGF5 TGFp, VEGF). Показано увеличение экспрессии мРНК генов ILlB5 IL6, IL8, ILlO5 IPlO5 FGFB5 VEGF при стимуляции моноцитов аналогом аденозина. Концентрация IL-1Р, IL-6, IL-8, IL-IO5 IP-10, PFGF5 TGFp в кондиционной среде вне зависимости от режима стимуляции оставалась неизменной, а уровень VEGF при стимуляции NECA значительно возрастал.
В проведенном исследовании впервые продемонстрирован высокий регенеративный потенциал модифицированных аденозином моноцитов при заживлении ожоговой раны.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты о влиянии стимуляции аденозиновых рецепторов на иммунофенотипический и цитокиновый профиль моноцитов способствуют пониманию роли аденозина в процессах воспаления и регенерации.
Эти данные могут являться основой разработки новых лекарственных средств для терапии воспалительных заболеваний. Выявленный в рамках настоящего исследования высокий регенеративный потенциал модифицированных аденозином моноцитов может быть использован для разработки новых подходов в области регенеративной и эстетической медицины. Увеличение скорости заживления ожоговой раны, наблюдаемое в эксперименте, свидетельствует о возможности применения модифицированных аденозином моноцитов в первую очередь для лечения ожоговых больных.Используемые в настоящей работе иммунологические и молекулярнобиологические методы могут быть рекомендованы для включения в программу подготовки курсовых и дипломных работ студентов на базе подразделения клеточных технологий и иммунологии Научнообразовательного центра «Клиническая и экспериментальная иммуногенетика» ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.
Методология и методы исследования
В исследовании были использованы современные методы, позволяющие оценить влияние аденозиновой стимуляции на профиль моноцитов. Оценку иммунофенотипического профиля исследуемых клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител к характеристическим маркерам дифференцировки моноцитов в дендритные клетки (CDla, CD 14, CD209). Для изучениия влияния аналога аденозина на уровень экспрессии моноцитами мРНК генов аденозиновых рецепторов и цитокинов были использованы молекулярнобиологические подходы: выделение мРНК из клеток, постановка реакции обратной транскрипции, проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени с красителем SYBR Green. Определение концентрации цитокинов в кондиционной среде модифицированных моноцитов осуществляли методом иммуноферментного анализа. Оценку регенеративного потенциала модифицированных аденозином моноцитов in vivo проводили на модели ожоговой раны у крыс линии Wistar. Планиметрическое исследование области ожоговой раны в динамике проводили с использованием программного обеспечения ImageJ.
Оценку гистологических изменений ожоговой раны осуществляли с применением стандартных гистологических методов - окраски гематоксилин-эозином и по методу Ван Гизона.Положения, выносимые на защиту
1. Моноциты, модифицированные аденозином in vitro, обладают измененным иммунофенотипическим и цитокиновым профилем. Под влиянием аденозина моноциты изменяют направление своей дифференцировки, приобретая иммунофенотип CDla'CD14+CD209+. Стимулированные клетки характеризуются повышенной экспрессией мРНК генов цитокинов, способных оказывать моделирующее влияние на регенеративные процессы - ILlB, IL6, IL8, IL10, IP10, FGFB, VEGF.
2. Моноциты, модифицированные аденозином in vitro, обладают высоким регенеративным потенциалом при введении вокруг области ожоговой раны у крыс. Закрытие дефекта кожных покровов и эпителизация ожоговой раны у животных, которым вводили аденозин-модифицированные моноциты, происходит в ускоренные сроки.
Степень достоверности и апробация результатов
Результаты диссертационной работы имеют высокую степень достоверности, что обеспечивается большим объемом проанализированных образцов, использованием современных методов исследования (культивирование, проточная цитофлуориметрия, полимеразная цепная реакция в реальном времени, иммуноферментный анализ, планиметрический анализ, гистологический анализ) и статистической обработки полученных данных.
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на V Всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2013), конкурсе научно-инновационных проектов в рамках Общероссийского научно-практического мероприятия - Эстафета «Вузовская наука-2013» (Томск, 2013; Москва, 2013), 88-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2014), LLXV ежегодной итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины - 2014» (Санкт-Петербург, 2014), XV конференции «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2014), Международной XIII научной конференции студентов и молодых ученых «Медицина завтрашнего дня» (Чита, 2014), Международном форуме «Фармацевтика и медицинские изделия» (Томск, 2014), научном семинаре совместно с Институтом клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск, 2014), семинарах научно-образовательного центра «Клиническая и экспериментальная иммуногенетика» (Томск, 2013-2014), ученом совете Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (Томск, 2014).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 2 полнотекстовых журнальных статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент Российской Федерации на изобретение «Способ модификации моноцитов периферической крови для повышения их паракринной активности при аутологической трансплантации» №2497947 от 15 августа 2012 г.
Объем и структура диссертации
Работа изложена на 156 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), главы «Материал и методы исследования» (глава 2), главы «Результаты и обсуждение собственных исследований» (глава 3), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 49 рисунками и 4 таблицами. Библиографический список содержит 237 работ, из которых 220 принадлежит зарубежным авторам.