4.1. Изучение микробиоценоза ротоглотки и кишечника в носоглоточных смывах и фекалиях

При проведении лабораторных методов обследования мы использовали методы диагностики детей с ОСЛ(крупом) таким образом, чтобы можно было с позиций доказательной медицины установить ведущую роль вирусной и/или бактериальной этиологии заболевания, оценить форму тяжести и необходимости своевременного назначения этиотропной терапии.

С целью выявления этиологии заболевания были проведены бактериологические, вирусологические и масс-спектрометрические методы исследования.

Определять у каждого больного наличие респираторного вируса в смыве ротоглотки нецелесообразно, так как уже доказано, что и у здоровых детей можно с помощью ПЦР выделить респираторные вирусы из ротоглотки (рисунок 4)

Рисунок 4. Результаты исследования носоглоточных смывов у ЧБД c ОРЗ (n=55) - I и без ОРЗ (n=51) - II методом ПЦР(Замахина Е.В., 2009г.

А при проведении выборочных вирусологических исследований у всех детей определялся какой-либо, а нередко и 2 респираторных вируса. Преобладание того или иного респираторного вируса в выборке зависело от сезона, когда проводилось исследование(рисунок 5).

Рисунок 5. Этиология ОРВИ у 60 детей ОСЛ(крупом)(ІХ - XI 2008г)

В результате многочисленных исследований микробиоценоза ротоглотки бактериологическим методом было выявлено, что полученные результаты напрямую связаны с качеством работы микробиологической лаборатории. Так, при изучении частоты обнаружения микроорганизмов в посевах слизи из носа и ротоглотки у 2761 больных, находящегося на лечении в МДГКБ за 2007г. бактериологическим методом было выявлено, что в 62,4% случаев наблюдения отмечался отрицательный результат (рисунок 6).

Рисунок 6. Частота обнаружения микроорганизмов в посевах слизи из носа и ротоглотки у 2761 больного, находящегося на лечении в МДГКБ за 2007г.

Подобной ситуации не может быть только потому, что в существующем приказе 535 от 22.04.1985г. исследование биоценоза ротоглотки проводится не только качественным способом, но и определяется количественное содержание микроорганизмов на слизистой ротоглотки с учетом существующих норм, рассчитанных в КОЕ/тампон. В соответствии с методическими рекомендациями, изложенными в приказе №535 МЗ РФ от 1985г., были приняты следующие нормативы: Staph. aureus -10¹ -10² ; Str. haemolyticus - 10³ -10⁴ ; Enterococcus - 10¹ -10² ; E. coli - 10¹ -10² ; C. albicans - 10¹ -10² ; Bacillus - 10² ; Klebsiella 10¹ -10² ; Streptococcus 10³ -10⁴ ; Staph. saprophyticus 10¹ ; Candida sp. - 10¹.

При выборочном проведении бактериологического обследования в лаборатории микробиологии НИИЭиМ им.Н.Ф.Гамалея за I - V 2007г. У каждого больного высевалось по 3-4-5 возбудителя, но их бактериальный спектр также соответствовал «лабораторному стандарту».

Рисунок 7. Частота обнаружения микроорганизмов в посевах слизи из ротоглотки у 60 больных ОСЛ (крупом) с бактериальными осложнениями (по данным НИИЭиМ им.Н.Ф.Гамалея за I - V 2007г)

При исследовании больных с ОСЛ(крупом) в течение 2006г. также в лаборатории микробиологии НИИЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи среди выделенных микроорганизмов наиболее часто и с высокой степенью обсемененности у детей обнаруживались золотистый и сапрофитный стафилококки (65%), haemophilus spp.(62,5%), стрептококки различных видов (альфа, бета и гамма) (60%), значительно реже грибы рода Candida и другие патогены.

На основании микробиологических сдвигов у 29(72,5%) больных отмечался дисбиоз полости рта III степени, у 11(27,5%) - дисбиоз IV степени.

Рисунок 8. Частота обнаружения микроорганизмов в посевах слизи из ротоглотки у больных ОСЛ (крупом) n=80

( по данным лаборатория микробиологии НИИЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи, 2006г).

При проведении микробиологического исследования микрофлоры ротоглотки у детей с ОРВИ среди выделенных микроорганизмов в 25,8% обнаруживались стафилококки, среди которых золотистый составлял 45%; в 24,4% - стрептококки, среди которых бета и альфа-гемолитические составляли 24,4%; в 14% - нейссерии, среди которых в 43% случаев log титров был >6; в 14% - haemophilus spp.; в 6% - грибы рода Candida; в 10,1% выделялись другие патогены.

На основании микробиологических сдвигов у 38(76%) больных мы диагностировали отмечался дисбиоз полости рта III степени, у 12(24%) - дисбиоз IV степени.(рисунок 9)

Рисунок 9. Биоценоз ротоглотки у больных ОРВИ (n=200) (по данным НИИЭиМ им.Н.Ф.Гамалея за 2006г)

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при проведении бактериологического метода исследования у каждого ребенка выделяется «традиционная» для микробиологического обследования флора, но с различным уровнем колонизации.

При проведении микробиологического исследования микрофлоры кишечника у детей с ОСЛ(крупом) среди выделенных микроорганизмов также выделялась типичная для биоценоза кишечника флора.

По совокупности клинико-лабораторных данных у 21 (56,8%) больных диагностировали дисбиоз кишечника III степени, у 16 (43,2%) - дисбиоз IV степени (рисунок 10).

Рисунок 10. Биоценоз кишечника у больных ОСЛ (крупом) с

бактериальными осложнениями (n=106) (по данным микробиологической лаборатории «Инвитро» за 2008г)

В облигатной флоре кишечника у больных ОСЛ(крупом) с бактериальными осложнениями отмечался у 34(91,8%) детей - дефицит лактобактерий, у 21(56,8%) - кишечной палочки, у 18(48,6%) - фекальных стрептококков, у 27(73%) - бифидобактерий, у 15(40,5%) выделен золотистый стафилококк, у 9(24,3%) - лактозоотрицательная культура энтеробактерий (рис.унок 11).

Рисунок 11.

Факультативная флора кишечника у больных ОСЛ(крупом) с

бактериальными осложнениями была представлена большой колонизацией как патогенной, так и условно-патогенной флорой (рисунок.12).

Рисунок 12. Факультативная флора кишечника у больных

ОСЛ(крупом) с бактериальными осложнениями

Таким образом, при проведении бактериологиченского изучения микробиоценоза смывов из ротоглотки и флоры кишечника было выявлено наличие идентичной флоры, колонизирующей все слизистые оболочки ЖКТ и являющейся «традиционной» для данного метода обследования.

Клинический пример 1

В качестве примера ОСЛ (рецидивирующий круп) с наличием выраженных дисбиотических изменений в ротоглотке приводим следующее наблюдение.

Ярослав В., 10 лет страдает рецидивирующим крупом с 2001г., на момент обследования рецидив крупа отмечался 8 раз, последний - в 2009г.. Впервые круп развился в 1,5 года, в течение последующих лет повторялся по 2 раза в год с постоянной госпитализацией в стационар. Рецидивы крупа были связаны с ОРВИ, при каждом заболевании получал антибактериальную терапию.

Из анамнеза известно, что ребенок от 1 беременности, протекавшей с токсикозом в 1-ю половину беременности. Роды в срок, естественым путем. Период новорожденности протекал без особенностей. Находился на смешанном вскармливании до 4-х месяцев, затем был переведен на искусственное вскармливание, после чего стали отмечаться аллергические реакции в виде пятнисто-папулезных высыпаний на коже. В дальнейшем развилась поливалентная аллергия. Привит по возрасту, после введения менингококковой вакцины развился очередной рецидив крупа. Из перенесенных заболеваний: ежемесячные ОРВИ до 7 лет, 2 раза бронхит, ветряная оспа.

Наследственность: у матери отмечаются аллергические реакции на лекарства до развития отека Квинке, у бабушки по линии матери - дермато­респираторный синдром, у двоюродного брата - рецидивирующий круп (до 12 лет отмечался до 30 раз), еще у одного двоюродного брата из этой же семьи - частые ОРВИ с явлениями ларингита.

При осмотре предъявляет жалобы на частые ОРВИ, першение в ротоглотке, чихание, нервозность.

При осмотре: кожные покровы бледные, периорбитальный цианоз, выраженность сосудистого рисунка на коже головы. Мальчик правильного телосложения. Аппетит снижен, физически мало активен. Пальпируются множественные шейные, подчелюстные, подмышечные, паховые лимфоузлы размером 1,0х1,5мм, эластичные, безболезненные, не спаянные с окружающей клетчаткой.

Слизистая ротоглотки с явлениями застойной гиперемии, задняя стенка глотки ярко гиперемирована, со множеством лимфоидных образований, стекает вязкая слизь. Небные миндалины гипертрофированы, рыхлые, с выделяющимися лакунами Язык тотально обложен бело-желтым густым налетом. Носовое дыхание затруднено, отмечается серозногнойное отделяемое. При перкуссии легких определяется легочной звук с коробочным оттенком. Дыхание в легких жесткое, проводится во все отделы. Тоны сердца звучные, ритмичные, выслушивается систолический шум во П-м межреберье слева и на верхушке, который при физической нагрузке не наростает. Живот мягкий, доступен глубокой пальпации, болезненный в эпигастральной области, печень и селезенка не выступают из-под края реберной дуги. Периодически отмечаются эпизоды диареи. Ребенок вялый, при осмотре мало контактный. В школе успеваемость хорошая, но занимается в основном дома.

При обследовании:

1. В общем анализе крови: Hb-112 г/л; эритроциты - 4,9х10¹²/л; лейкоциты - 8,5х10⁹/л; (лейкоцитарная формула: пал. - 5%, сегм. - 34%, лимф. - 52%, мон. - 1%, эоз. -8%); СОЭ -14 мм/час.

2. В общем анализе мочи патологии не выявлено.

3. При исследовании биоценоза ротоглотки: Staph. aureus -10⁵; Str. haemolyticus -10⁴ ; Enterococcus -10³; E. coli - 10⁴; C. albicans -10⁵; Bacillus - 10⁴; Klebsiella -10⁵; Streptococcus -10⁷ ; Staph. saprophyticus - 10⁴ ; Candida sp.

Анализ результатов исследования показал наличие дисбиоза ротоглотки IV степени за счет превалирования колонизации патогенной и грибковой флоры.

На основании данных анамнеза, объективного осмотра, данных лабораторных методов обследования можно думать о диагнозе: ОСЛ(рецидивирующий круп). Аллергический ринит. Хронический гипертрофический фарингит. Хронический тонзиллит, компенсированная форма. Хронический гастродуоденит. Дисбиоз ротоглотки IV степени. Заключение. В данном случае у ребенка с ОСЛ(рецидивирующий круп), имеющим хроническую ЛОР-патологию ротоглотки, имеет место выраженная колонизация микроорганизмами ротоглотки за счет превалирования стрептококков среди аэробных микроорганизмов и обнаружения Branchamella catarrhalis, не характерных для нормоценоза, которые могут способствовать колонизационной резистентности организма.

4.2. Изучение факторов патогенности и других вероятных признаков бактериальной инфекции

Учитывая однородность выделения бактериальных маркеров у обследованных детей и невозможность определения основного или основных возбудителей в этиологии заболевания с целью верификации возможных

изменений клинической симптоматики и формы тяжести текущего инфекционного процесса мы прибегли к определению метаболитов стафилококка - стафилококковых энтеротоксинов (СЭ. Работа проводилось в лаборатории микробиологии НИИЭиМ им.Н.Ф.Гамалеи,2008г. Д.б.н. Флуер Ф.С., зав.лаб. Д.б.н., проф.Прохоров В.Я.

На момент исследования была возможность определения только Энтеротоксинов А и В, которые выделялись в чистой культуре Staphylococcus.

Из 10 обследованных детей у 4 детей был выделен Staph. Aureus; у 2 - Staph. Epidermidis ; у 2 - Staph.haemolyticus; у 1 -Staph. Capitis; у 1-Staph.xylosus;. Большинство (80%)детей были младшего возраста.

Никаких особенностей в клинике заболевания у этих детей мы не отмечали.

В результате проведенного обследования ни в одном случае наблюдения мы не имели положительного результата. Полученные отрицательные результаты в определении токсинов по проведенному нами исследованию можно объяснить тем, что во всех случаях наблюдения при получении антибактериальной терапии чувствительные штаммы к антибиотику исчезали или изменяли свои культуральные свойства.

Определение других энтеротоксинов скорее всего было нецелесообразно, так как чаще всего (по данным д.б.н. Флуер Ф.С., зав.лаб. д.б.н., проф.Прохоров В.Я.) выделяется СЭ «А» и «В».

Подтверждением тому является исследование проведенное сотрудником нашей кафедры Адеишвили П.С., которая обследовала 10 больных с инфекционным мононуклеозом, у которых отмечались наложения на миндалинах. При бактериологическом исследовании был выделен Staph., все эти дети не получали до обследования антибактериальной терапии.

В результате проведенного обследования у больных с инфекционным мононуклеозом в 90% случаев определялся токсин «А», в 80%-токсин «В», в 40% - токсин «Д».

Таблица2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТЕРОТОКСИГЕННОСТИ STAPHYLOCOCCUS по продукции (SEA, SEB, SECI2, SED, SEE) и токсина токсического шока (TSST-1) лаборатория микробиологии НИИЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи, 2008г.Д.б.н. Флуер Ф.С., зав.лаб. Д.б.н., проф.Прохоров В.Я.

Кроме того для оценки формы тяжести и выраженности воспалительной реакции мы использовали ядерный и лейкоцитарный индексы интоксикации, которые рассчитывали по результатам общего анализа крови. С помощью простого расчета объективно регистрируется как среднетяжелая, так и декомпенсированная форма тяжести заболевания, которая развивается в результате того, что значительная часть токсичных продуктов белковой природы и эндотоксинов фиксируется на микросгустках и агрегатах и, выключаясь из общего кровотока, снижает токсичность крови.

В результате проведенного обследования у всех детей отмечалась средне­тяжелая форма заболевания. Однако, средняя форма тяжести с умеренными признаками интоксикации отмечалась только у 29,5% больных, в 70,5% случаев наблюдения заболевание протекало с выраженными признаками интоксикации (рисунок ___).

Рисунок 13 Форма тяжести заболевания у больных ОСЛ (крупом) с бактериальными осложнениями по ядерному индексу интоксикации (ЯИИ) (n=106)

С-реактивный белок определяли (СРБ) у 32 больных, его средние значения составили - 0,012 ± 0,2 г/л ( при норме >70 мг/л= 0,007 г/л)

Таким образом, полученные данные об отсутствии СЭ у детей с ОСЛ(крупом) на фоне лечения антибактериальными препаратами свидетельствуют о нецелесообразности проведения подобного метода диагностики для уточнения этиологии заболевания. Кроме того выделение СЭ является достаточно длительным процессом, что также является препятствием для своевременной установки этиологии заболевания. Определение СРБ и ЯИИ являются точными и быстрыми методами для подтверждения бактериальной этиологии заболевания, однако в клинической практике нередко отмечается «запаздывание» изменений со стороны лабораторных методов исследования. Поэтому в настоящее время постоянно идет поиск более совершенных методов диагностики, позволяющих быстро и полноценно оценить этиологию заболевания.

В качестве примера тяжелого течения ОСЛ (крупа), при котором не отмечалось достоверных признаков бактериальной инфекции (изменения лабораторных показателей были отсрочены по сравнению с клиникой заболевания) приводим следующее наблюдение.

Клинический пример 2

Азамат Б.находился в отделении реанимации МДГКБ с 03-05.04.2010г. в 18 и/о 05-27.04.2010г. по поводу диагноза: Острый стенозирующий ларингит (круп), стеноз гортани II степени на фоне ОРВИ. Обструктивный бронхит, ДН II степени.

Ребёнок от матери 38 лет соматически здоровой, от 6 беременности, протекавшей с токсикозом во 2 половине беременности (находилась на стационарном лечении) от 3 запоздалых родов на 42 неделе беременности

При рождении масса тела = 4620грамм Закричал сразу, был приложен к груди на 3 сутки (в связи с тяжелым состоянием матери- множественные разрывы).Выписан на 11 сутки. Рос и развивался в соответствии с возрастом. На диспансерном учете у специалистов не состоит. Находился на смешенном вскармливании до 3,5 месяцев, а затем в связи с отъездом матери был переведен на искусственное вскармливание (смесь агуша -1).В 4 месяца в связи с явлениями дисбиоза и изменения характера стула был переведен на смесь NAN-1. C 4х месяцев начал получать первый прикорм -рисовую кашу, с 4,5 месяцев фруктовые соки(яблочный, персиковый).Первый зуб появился в 5 месяцев. Перенесенные заболевания: заболел впервые, антибиотики не получал. Привит в соответствии с принятым национальным календарем прививок:первые 12 часов жизни- первая вакцинация против вирусного гепатита В. На 7 день-вакцинация против туберкулеза. В3 месяца- первая

вакцинация против дифтерии, коклюша, столбняка, первая вакцинация против полиомиелита, вторая вакцинация против вирусного гепатита В. Отмечалась реакция на введение вакцины против дифтерии, коклюша, столбняка и полиомиелита в виде подъема температуры до 38,0C в течение 2-х дней. В 5 месяцев (16.03) вторая вакцинация против дифтерии, коклюша, столбняка, вторая вакцинация против полиомиелита. Также отмечалась реакция на введение вакцины в виде подъема температуры до37,8- 38,0C в течение 2-х дней. Наличие аллергических заболеваний и реакций на лекарства, бытовые и пищевые аллергены отрицает. У аллерголога не наблюдается. Наличие у родственников аллергических заболеваний отрицает. Социально-бытовые условия удовлетворительные. Проживает в отдельной 2х-квартире на 4 этаже, с 4 взрослыми (мама, папа, сестра 17 лет).

Эпидемиологический анамнез: контакты с инфекционными больными отрицает.

01.04 .10г. мать отметила появление белого налета на языке, деснах, слизистых щек, обильную саливацию. Лечились самостоятельно (обрабатывала слизистые раствором соды). 02.04 обработала слизистую рта раствором Люголя и вечером дала ребенку порошок стрептоцида. 02.04 вечером отмечалось ухудшение состояния: подъем температуры до 39,5С самостоятельно пытались снизить температуру (нестероидный противовоспалительный препарат-суспензия нурофен 2,5 мл внутрь). Появилась одышка, сухой кашель.03.04 повторный подъем температуры до 39,5С повторно дали ребенку нестероидный противовоспалительный препарат(суспензия нурофен 2,5 мл внутрь). Эффекта не было. Была вызвана бригада скорой медицинской помощи. Бригадой скорой помощи на догоспитальном этапе было проведено: комбинированный бронхолитический препарат: беродуал 6 капель ингаляционо с помощью небулайзера; глюкокортикостероид для местного применения: пульмикорт 0,25 мг ингаляционо с помощью небулайзера; синтетический гормональный

препарат: раствор дексаметозона 2 мг внутримышечно; во время транспортировки оксигенотерапия.

Ребенок был доставлен бригадой скорой медицинской помощи в реанимационное отделение МДКБ с диагнозом: « Острый стенозирующий ларинготрахеит (круп), стеноз гортани III степени на фоне ОРВИ. Обструктивный бронхит, ДН 2-3 степени.

При осмотре в реанимационном отделении МДГКБ: Состояние тяжелое. Беспокойный. Голос осиплый. Большой родничок 1,5*1,5 см не пульсирует, не выбухает. Кожные покровы чистые, горячие, бледные, акроцианоз, периорбитальный цианоз. Симптомы токсикоза выражены. Слизистые бледно-розовые, чистые. Дыхание самостоятельное, ритмичное, выражена инспираторная одышка. Кашель редкий, лающий. При аускультации дыхание ослабленное, проводиться над поверхностью обеих легких, симметричное. Тахикардия.

При обследовании выявлено: Газовый состав крови

На рентгенограмме органов грудной клетки выполненной лежа на выдохе. Тень средостенья смещена вправо за счет поворота. В видимых отделах легких сосудистый рисунок обогащен. Правый контур сосудистого пучка выбухает, вероятно, за счет суммации с вилочковой железой. Сердце широко прилежит к диафрагме. Диафрагма четкая. Синусы дифференцированы. Дистальный отдел в/в катетера справа на уровне тела C2.Виgна тень толстого катетера на уровне заднего отрезка V ребра слева.

В общем анализе крови от 03.04(3-й день болезни): Hb-117 г/л; эритроциты - 4,5х10¹²/л; лейкоциты - 12,6х10⁹/л; (п-9%, с-41%, л -40%, м -5%, э -5%); СОЭ -20 мм/час. В общем анализе мочи от 04.04.- ураты в значительном количестве, белок -0,040;другие показатели в норме.

В биохимическом анализе крови: общий белок - 64 (65-85 г/л); Триглицериды - 6,65(0,45-1,7 ммоль/л); В-липопротеиды - 28(35-55 Ед.);

Серомукоид - 0,27(0,100-0,200 Ед.); ЛДГ - 605(До 480 Ед/л); СРБ - 0,004(до 0,001г/л). Другие показатели в норме.

Было назначено лечение: пункционная катетеризация подключичной вены справа по Сельдингеру, Цефтриаксон 500мг*2 раза в/в струйно; дексазон 6 мг в/в струйно;инфузионная терапия; беродуал 5 капель ингаляционо с помощью небулайзера; пульмикорт 0,25 мг ингаляционо с помощью небулайзера. После проведенной терапии в реанимационном отделении состояние улучшилось, ребенок переведен в 18 инфекционное отделение.

На момент поступление в отделение: состояние тяжелое, ребенок беспокоен. Кожа смуглая, на мошонке, в паховых областях мелкая пятнисто­папулезная сыпь. Слизистые ротоглотки гиперемированы, отмечаются белесоватые наложения на миндалинах. Голос осиплый, кашель сухой

лающий. Возникает инспираторная одышка при нагрузке. При аускультации дыхание жесткое, проводные хрипы с обеих сторон. Живот мягкий, безболезненный. Увеличение печени + 4. Стула не было. Мочеиспускание свободное.

Заключение: на основании данных анамнеза заболевания, данных осмотра у ребенка имеет место диагноз: Острый стенозирующий ларингит (круп), стеноз гортани II степени на фоне острого респираторного заболевания. Обструктивный бронхит, ДН II степени. Грибковый дерматит

Таким образом, данный клинический пример объективно доказывает ведущую роль бактериальной инфекции в развитии заболевания, при этом достоверные признаки бактериальной инфекции на момент обследования ребенка отсутствовали. Подобная ситуация в практике врача встречается не редко. Поэтому в повседневной практике не обязательно дожидаться

достоверных признаков бактериальной инфекции с целью оправданного назначения этиотропного препарата.