Методы исследования

Таблица 9.

Объем и методы исследования.

Оценка неврологического статуса наряду с анамнестическими данными, бальной оценкой по шкале APGAR и шкале Сильвермана, а также соматическим статусом и динамикой ранней адаптации базировалась на классификации перинатальных поражений нервной системы у новорожденных, предложенной в 2000 г.

Ультразвуковое исследование проводилось с помощью аппарата "SSA 270А" фирмы "Toshiba" всем обследованным детям при поступлении (4-7 сутки жизни), в возрасте 20 - 30 дней, а также при катамнестическом обследовании в Центре реабилитации маловесных детей - в возрасте 3 - 6 и 7 - 9 месяцев.

У всех пациентов данные эхоэнцефалографии были дополнены результатами оценки церебральной гемодинамики методами ультразвуковой допплерографии. Исследование кровотока проводилось методом транскракиальной цветовой импульсной допплерографии секторными датчиками с диапазонами частот от 2,5 до 3, 75 МГц по передней артерии, визуализирующейся на саггитальном срезе как двойной пульсирующий сигнал, разделенный узким просветом. Для более объективной оценки мозгового кровотока у новорожденных нами использовалась уголнезависимая величина - индекс резистентности (ИР), представляющая отношение разности скоростей конечного систолического и конечного диастолического кровотоков к конечной систолической скорости. В норме у новорожденных детей данный показатель колеблется между 0,5-0,8 [И.В. Дворяковский, 2000].

При проведении настоящего исследования учитывалось доказанное прогрессивно-линейное увеличение скорости мозгового кровотока с увеличением гестационного возраста и веса детей, однако при этом характерно определенное постоянство показателей индекса. Нами также учитывался фактор прямого влияния на состояние мозгового кровотока наличия у новорожденных функционирующих фетальных коммуникаций, пороков

развития сердца или сосудов, особенностей ритма сердца, характер сердечного кровотока в целом.

Для оценки степени морфологической и функциональной зрелости различных структур мозга и нейронного аппарата коры больших полушарий, определения взаимодействия коры и подкорковых регуляторных структур методом компьютерной электроэнцефалографии с картированием было обследовано 360 детей различного гестационного возраста.

При проведении настоящего исследования учитывалась полиморфность ЭЭГ у новорожденных детей, а также определенные трудности в ее интерпретации (наличие редких, низкоамплитудных, медленных нерегулярных волн, сопровождающихся короткими вспышками регулярных волн частотой от 5 до 13 гц; частые нереіулярньїс низкоамплитудные волны (до 50 гц) и значительные участки кривой, близкие к изоэлектрической линии; более длительный латентный период в ответ на вспышку света, что связано с замедленным проведением импульса по еще не миелинизированным зрительным путям); во внимание принимался не только календарный гестационный возраст, но и существующий дефицит в развитии (задержка внутриутробного развития), например, при синдроме small for date.

Церебральная оксиметрия (спектроскопия в близком к инфракрасному спектре) проводилась всем обследованным детям.

Принципы спектроскопии в близком к инфракрасному спектре (ВИКС) как метода мониторинга кислородного и гемодинамического статуса головного мозга были представлены в работах Jobsis в 1977 году. В настоящее время появилась возможность технической реализации этого метода и была создана соответствующая клиническим требованиям аппаратура. Суть метода заключается в измерении степени абсорбции света в диапазоне волн от 700 до 1000 нм, проходящего через биологические объекты. В пределах данного диапазона единственными биологическими субстанциями, имеющими кислородозависимые спектры поглощения, являются гемоглобин (как

связанный с кислородом, так и дезоксигемоглобин) и цитохромоксидаза. Цитохромоксидаза, являясь конечным ферментом дыхательной цепи, катализирует более 95% утилизации клеточного кислорода, и её окислительный статус (RedOx-status) непосредственно отражает состояние тканевого дыхания клеток головного мозга. Окисленная форма СааЗ демонстрирует широкую полосу поглощения в диапазоне от 780 до 870 нм, с максимумом в области 840 нм. В восстановленном состоянии, т.е. при дефиците кислорода в клетке эта полоса исчезает. Пик поглощения дезоксигемоглобина (ННЬ) приходится на 780 нм, и по мере его перехода в окисленную форму, т.е. оксигемоглобин (О2НЬ), возникает широкая полоса поглощения в области 900 нм. Кости свода черепа и другие ткани достаточно проницаемы для электромагнитного излучения в названном спектре, что позволяет применять БИКС для оценки кислородного статуса головного мозга.

В клинике церебральная оксиметрия применяется с конца 80-х годов, но уже накоплен значительный опыт использования этого метода для диагностики церебральной ишемии и оценки перфузии головного мозга. Следует отметить, что первый опыт применения данного метода был получен именно в неонатологии. Это связано с тем, что малые размеры головы и толщина кожи и костей свода черепа у новорождённых детей позволяли проводить спектроскопию в проходящем свете.

SOMANTTICS

Adult ! Pediatric

^L65

63

^R65

■ S3

Рис.

Это устройство предназначено для измерения содержания оксигемоглобина и дезоксигемоглобина в ткани головного мозга. Кроме этих показателей можно оценивать два производных параметра: общее содержание гемоглобина (tHb), то есть сумма О2НЬ и ННЬ, и локальное тканевое насыщение гемоглобина кислородом (RSAT), которое является отношением О2НЬ к tHb. Нужно заметить, что понятие "локальное тканевое насыщение" означает степень насыщения всего гемоглобина, находящегося в определённом объёме ткани, и не тождественно по содержанию понятию "артериальное насыщение гемоглобина (SaO2)", характеризующему степень насыщения гемоглобина в артериальном русле (измеряемого методом пульсовой оксиметрии). CRlTIKON(tm) Cerebral RedOx Monitor 2020 и NIRO-500, кроме упомянутых фракций гемоглобина, позволяют определять степень окисления

цитохромоксидазы в клетках головного мозга. В настоящее время разработан математический аппарат, основанный на принципе Feck’a и законе Веег- Lambert’a, позволяющий рассчитывать абсолютные величины концентрации гемоглобина в головном мозге и общего церебрального кровенаполнения.

В большом количестве исследований проводится сравнительный анализ данных, полученных с помощью церебральной оксиметрии и других методов исследования. Mason с соавт. (1994) в своей работе сообщают о высокой степени корреляции с данными, полученными при транскраниальной допплерометрии. Skov с соавт. (1991) измеряли объём мозгового кровотока у новорождённых методом церебральной оксиметрии и по клиренсу ІЗЗХе и пришли к заключению, что полученные результаты практически идентичны.

Цитохимическое исследование крови. Для определения ферментного статуса лимфоцитов по активности СДГ проводился забор капиллярной крови. Мазки крови фиксировались в течение 1 минуты фиксатором ацетон-трилоном. Проводилась инкубация при 37° в течение 30 минут в 40 мл фосфатного - (с трилоном В) pH 7,4, содержащего 27 мг янтарнокислого натрия.

за 15-20 мин и через 40-50 мин после инъекции, перед и после перорального введения комплекса метаболитов или нанесения местного анестетика и у контрольной группы с тем же временным интервалом. Применение анализатора изображений клетки «ДИАМОРФ» позволяет сочетать изучение совокупности органелл и совокупности клеток. Результат цитохимической реакции зачитывается в виде нескольких блоков параметров. В основу описания ферментной реакции положено определение площади, занимаемой депозитом, периметра, оптической плотности (пропускание света) и разнородности депозита по оптической плотности.

Определение сукцинатдегидрогеназы выполняли по методу, основанному на способности солей п-нитротеразолия фиолетового образовывать нерастворимые в воде гранулы диформазана за счет восстановления солей при

окислении субстратов в местах активности ферментов. (Р.П.Нарциссов, 1969). Морфометрию цитохимической реакции выполняли с помощью анализатора изображений клетки “ДИАМОРФ” (авторы программы А.В.Жукоцкий,Н.И.Якубова).

Основные морфометрические показатели тесно связаны с параметрами распределения депозитов, графа и “ячеек” По показателям гранул можно ориентировочно оценить состояние популяции клеток. Зная разнородность, уравновешенность популяции клеток можно сказать определенно о разнородности органелл. Анализатор изображений клеток позволяет определить сдвиг ферментного статуса лимфоцитов в момент очень непродолжительной, но интенсивной мышечной работы у тренированного спортсмена.

Многообразие признаков клетки по особенностям размеров, форме, плотности и внутренней изменчивости энзиматических очагов позволяет ввести для сс характеристики градацию нормальности: степень совпадения с наиболее типичным состоянием и, оборот, степень отклонения от средней величины. Богатство морфометрических признаков позволяет не только хорошо различать разные состояния между собой, но и внутри популяции выявить клетки, характерные для состояний тренированности, беременности, ОРЗ, так и клетки с ферментным статусом, не встречающиеся при упомянутых состояниях.

Количественный анализ содержания N0 по его стойким метаболитам - ионам N0₃‘ и N0₃‘ в биологических образцах (в данном случае - в сыворотке крови) проводили с использованием индикаторного набора реагентов и спектрофотометра DU-50 (Beckman, USA), при длине 520 нм.

Методика определения оксида азота в сыворотке крови заключалась в предварительной обработке и собственно количественном анализе. Для осаждения белка к 1 мл сыворотки крови добавляли 100 рл 35% сульфосалициловой кислоты. Пробы тщательно перемешивали и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Пробы центрифугировали и оставляли при 5000g 15 мин (центрифуга J-21 фирмы Backman, USA) для полного осаждения белка и супернатант после доведения pH 10 рл 5N NaOH до 7,4 - 8,0 использовали для определения метаболитов оксида азота.

Принимая во внимание тот факт, что в водной среде нитрит ион крайне нестабилен и быстро переходит в нитрат ион NO₃', не регистрируемый спсктрофотометрически, для количественного определения уровня оксида азота предварительно проводилась обработка проб индикаторным порошком. Индикаторный порошок представлял собой гомогенную сухую смесь, содержащую цинковый порошок, сульфаниловую и хромотроповую кислоты и катализатор диазотирования. После растворения порошка в анализируемом растворе биологического образца происходит восстановление нитрат-иона в нитрит-ион (процент выхода - 85%), который вступает в реакцию

диазотирования-азосочетания с компонентами индикаторного порошка (сульфаниловая кислота и а-нафтиламин). При этом образуегся окрашенное в красный цвет соединение в количестве, пропорциональном содержанию нитрита в анализируемом растворе. Измерение оптической плотности проводили через 15 мин после добавления реактива из расчета 10 мг порошка на 1 мл образца. Расчет результатов производили по градуировочному графику, построенному по 6-ти известным концентрациям NaNO₃, обработанного по вышеуказанной методике.

Регистрацню систолического (САД), диастолического (ДАД) и среднего АД (Аср) производили осциллометрическим методом с помощью мониторов ВР-3200 (ЕМБ) Великобритания и ВХ-5 (Colin, Япония). Подбор одноразовых манжеток осуществлялся индивидуально с учетом длины округлости плеча ребенка, согласно имеющимся в литературе рекомендациям. Частота сердечных сокращений (Час) определялась теми же аппаратами. Измерения производились через каждые 60 минут на протяжении первых восьми суток жизни, затем с периодичностью 1 раз в 2, 5 мес.

Полученные результаты печатались на бумажной ленте и вручную вводились в персональный компьютер. При обработке данных во всех случаях нами были взяты числовые ряды длительностью 24 часа. Полученные числовые ряды для всех указанных переменных обрабатывались с помощью одиночного косинор анализа для выявления суточных (период - 24 часа) ритмов с оценкой этих ритмов. При этом методом наименьших квадратов проводилась аппроксимация числовых рядов синусоидальными кривыми, каждая из которых характеризовалась своей амплитудой, акрофазой, мезором. Ритмы расценивались как статистически достоверные, если гипотеза о нулевой амплитуды отвергалась при уровне значимости 0,05. Как указывалось нами ранее, мезор 24 ритма представляет собой среднесуточное значение изучаемого показателя; под амплитудой понимается максисимальное значение аппроксимирующей синусоиды ио отношению к мезору. Акрофаза - это время, в которое достигается указанное значение.

Основные параметры коагуляционного гемостаза определяли с помощью реагентов НПО «Ренам» и НПО «Медиолаб» (Москва) и анализатора Option-8 (Bio Merieux, Франция).

Концентрация ксантина и гипоксантина в плазме крови у новорожденных детей определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

при поступлении, а чакже через 1 и 2 недели после начала комплексной терапии.

Оценку болевой реактивности новорожденных детей проводили визуально по бальной шкале при выполнении внутримышечного введения назначенных лекарственных препаратов в условиях мониторирования функционального состояния с помощью системы CONAN (регистрационное удостоверение М3 и МП РФ Х?29-39/16-902-95), позволяющего одновременно регистрировать ЭЭГ, ЭКГ и пульсометрию с последующей компьютерной обработкой данных. С целью предупреждения болевого синдрома у 56 детей был применен комплекс метаболитов, состоящий из глицина (0,05 г), лимонтара (0,025 г), биотредина (0,05 г) («Биотики», Россия); у 10 детей были использованы аппликации местного анестетика, состоящего из 2,5% эмульсии лидокаина и 2,5% эмульсии прилокаина (препарат EMLA, Astra Pharma).

Перед проведением указанных исследований и терапевтических мероприятий у родителей всех наблюдавшихся детей было получено добровольное информированное согласие и гарантировано лечение с доказанной эффективностью.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программ STATISTIKA 6.0 и Microsoft Excel 2.0. Оценивались коэффициенты корреляции (точный критерий Фишера - Стыодента) при р < 0,05; проводился многофакторный анализ, дающий возможность оценки частоты и характера сочетаний определенных «риск-факторов». Последующий анализ выявленных причинно-следственных связей базировался на определении коэффициента корреляции Пирсона и коэффициента ранговой корреляции Спирмена при статистической значимости корреляции р < 0,05.