Определение кинетических констант

На рис.13 приведена зависимость в обратных координатах начальных скоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой C.rugosaи проростков пшеницы от концентрации субстрата в отсутствии (прямые 1) и в присутствии хитозана (прямые 2).

ммоль -mmаммоль «мин

-2-101234-101234

ммоль'ммоль'1

Рис.13.

скоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой C.rugosa(а) и

проростков пшеницы (б) от концентрации субстрата в отсутствии (1) и в

присутствии хитозана (2) при рН 6,7 и 30°С.

Проекция прямых на ось абсцисс позволила определить конкурентный тип  ингибирования  липаз  хитозаном.   Найденные  значения  константы

107

скорости kcat, константы Михаэлиса Км и константы ингибирования К,- липаз хитозаном представлены в таблице 19.

Таблица 19.

Кинетические константы реакции гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой C.rugosaи проростков пшеницы и константы ингибирования липаз хитозаном

Эффективность гидролазного действия растительной липазы на паранитрофенил пальмитат, выражаемая бимолекулярной константой kcat/KM, в 33 раза ниже, чем для липазы С.

С целью выяснения вклада электростатических взаимодействий положительно заряженных групп хитозана с отрицательно заряженными группами белка при образовании комплексов были изучены зависимости констант ингибирования липолитической активности хитозаном от концентрации добавленного в раствор хлорида натрия (рис.14).

Был проведен расчет числа аминогрупп хитозана, образующих ионную пару с отрицательно заряженной группой белка.

108

Kj, 10"3 моль 5-

3-

2-

0,05

ОД

0,3 [NaCl],Mlt;Mib

Рис.14. Зависимость в логарифмических координатах величин

Kj липазы C.rugosa(1) и проростков пшеницы (2) хитозаном от

концентрации хлорида натрия.

Величина п, численно равная тангенсу угла наклона прямых 1 или 2 к оси абсцисс на рис.14, имела значение 0,44 для липазы C.rugosaи 0,28 для липазы проростков пшеницы. Низкие значения величины п для обеих липаз свидетельствует о незначительном вкладе в свободную энергию комплексообразования электростатических взаимодействий зарядов хитозана и белка. С целью дополнительного подтверждения этого заключения мы провели измерения Kj грибной и растительной липаз низкомолекулярным N-сукцинил хитозаном.

  Ингибирование активности липаз низкомолекулярным N-сукцинил

хитозаном

  В этом производном хитозана каждая сукцинильная группа несет отрицательный заряд. Результаты измерений представлены на рис.15. Рассчитанные из этих данных К; активностей липазы C.rugosaи проростков пшеницы N-сукцинил хитозаном найдены равными 2,0-10" М и 1,7-10" М,

соответственно.

109

ММОЛЬ -MIО!ммоль «мгн

Рис.15. Графики зависимостей в обратных координатах начальных скоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой C.rugosa(а) и проростков пшеницы (б) от концентрации субстрата в отсутствии (1) и в присутствии (2) N-сукцинил хитозана при рН 6,7 и 30°С

Близость значений К; обеих липаз хитозаном со свободными аминогруппами и N-сукцинил хитозаном подтверждает вывод о незначительной роли электростатических взаимодействий при комплексообразовании хитозана с липазами, подавляющего их ферментативную активность.