Определение липолитической активности.  

Реакцию начинали добавлением 1 мл 0,5% раствора субстрата, перемешивали и выдерживали 10 мин при 30° С. Реакцию останавливали добавлением 2 мл 0,5 н раствора №2СОз, далее раствор центрифугировали в течение 10 мин при 5000 g. Изменение поглощения при 410 нм, обусловленное освобождением в результате реакции паранитрофенолята,

60

регистрировали спектрофотометрически. Коэффициент экстинкции е 4ю для паранитрофенолята принимали равным 15000 моль'см"1 [205]. За единицу липазной активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 ммоль/мин паранитрофенил пальмитата в приведенных выше условиях.

Липолитическую активность в гетерогенной среде определяли путем титрования жирных кислот, образовавшихся при гидролизе оливкового масла [206]. Реакция проходила при постоянном перемешивании в 0,005 М NaAc буфере (рН 6,7) содержащем 1 мМ дезоксихолат, 1 мМ СаС12, 10 г/л твин 80, 48 г/л оливкового масла при температуре 37°С в течение 30 мин. Реакционную смесь озвучивали в течение 10 минут в ультразвуковом гомогенизаторе («Bandelin Sonorex», Германия). Реакция начиналась при добавлении в реакционную смесь 0,1% липазы из С. rugosa, 5% липазы из проростков пшеницы или 0,1% свиной панкреатической липазы. Количество образовавшихся жирных кислот определяли титрованием 0,1 н КОН. В качестве контроля использовали пробу с неактивным ферментом.

Активность липазы рассчитывали по формуле:

A=(V-V')-10/t;

где V- объем 0,1 н КОН, затраченного на титрование свободных жирных кислот в опытной пробе, мл; V- объем 0,1 н КОН, затраченного на титрование свободных жирных кислот в контрольной пробе, мл; 10-поправочный коэффициент [206] для пересчета одного грамма олеиновой кислоты в мкмоли; t - время реакции, мин.