Количественная характеристика эффективности ингибирования липолитических ферментов. 

61

30 мин до момента добавления субстрата. Константы ингибирования К; определяли по методу Диксона [207] из сравнения зависимостей в обратных координатах скорости реакции от концентрации субстрата, в отсутствии и в присутствии ингибитора. Концентрацию паранитрофенил пальмитата, используемого в качестве субстрата, варьировали в реакционной смеси от 1,30-10"4 до 2,65-10'3 М. Концентрацию оливкового масла, используемого в качестве субстрата для определения липолитической активности в гетерогенной среде, варьировали от 0,34-10'3 М до 2,38-10"3 М.

Определение влияния концентрации хлорида натрия на константу диссоциации комплекса хитозан-липаза. Для оценки вклада электростатических взаимодействий между положительно заряженными аминогруппами хитозана и отрицательно заряженными группами белка в образование комплекса хитозан-липаза, измеряли зависимость константы ингибирования липазы хитозаном от концентрации добавленного в раствор хлорида натрия. Влияние концентрации соли NaCl на константу диссоциации комплекса может быть описано уравнением [208]:

log K| /log [СГ] = - n;

где п равно числу противоионов заряженных аминогрупп хитозана, освобождаемых при его связывании с липазой.

Определение суммарного количества белка проводили по методу Брэдфорд [209]. В пробирке смешивали 750 мкл раствора, содержащего определяемый белок, с равным объемом раствора красителя (Coomassie Brilliant Blue G-250 в 3% НСЮД Растворы выдерживали 15-20 мин до развития фиолетовой окраски. Далее измеряли поглощение раствора белка при А=600 нм относительно контрольного раствора. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин («Sigma», США).

Фракционирование низкомолекулярного хитозана. Полученные гидролизаты низкомолекулярного хитозана фракционировали методом дробной экстракции в системе этиловый спирт - вода [204]. Навеску 100 мг суспендировали в 10 мл 96 % этилового спирта при перемешивании в

62

течение 30 мин. Осадок отфильтровывали и повторно суспендировали в системе этиловый спирт - вода (7,5:2,5; 5:5; 2,5:7,5 и 0:10). Фильтраты после каждой экстракции концентрировали, лиофильно высушивали и определяли СД и Мл. Оставшийся после многократной экстракции осадок дважды промывали водой и высушивали в виде суспензии.