ЗАНЯТИЕ 2. ПРАВИЛА РАБОТЫ С МИКРООРГАНИЗМАМИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРИЖИЗНЕННЫХ И ПОСТОЯННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Основное требование при работе с микроорганизмами - соблюдение асептики, т. е. таких условий, при которых в пробирку с изучаемой культурой не смогли бы попасть другие микроорганизмы (например, из воздуха, с предметов, используемых в процессе выполнения работы).

Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериоло­гические петли, иглы, шпатели. Бактериологические петли изготовляют из проволоки, которую закрепляют в специальных металлических держателях или впаивают в стеклянные палочки. Толщина игл и петель не должна пре­вышать 0,5 мм (рис. 10).

Рис. 10. Бактериологическая петля (1) и шпатель Дригальского (2)

Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах или чашках Петри. В пробирках микроорганизмы культивируют как в жид­ких, так и на плотных средах. Пробирки со средами и культурами при работе следует устанавливать на штативах.

Бактериологическая петля прокаливается, пробки и край пробирки фламбируются. Если в работе используются суспензии микроорганизмов или культуры, выращенные на жидких средах, они берутся предварительно про­стерилизованной пипеткой, у которой широкий конец закрыт ватой. Такие пипетки стерилизуются и хранятся завернутыми в бумагу (каждая отдельно).

Изучают микроорганизмы, изготавливая препараты из них. Для этого применяют чистые, хорошо обезжиренные стекла, на поверхности которых капля воды свободно растекается. С этой целью промытые и высушенные стекла натирают хозяйственным мылом, увлажняют дыханием и протирают салфеткой.

При микроскопировании можно использовать культуры, выращенные в жидких средах. Культуры, выращенные на твердых средах, можно суспенди­ровать (развести) с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь раствора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения.

Для прижизненных наблюдений наиболее часто готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля». Работу проводят в следующем порядке:

1) приготовить предметное и покровное стекла;

2) зажечь спиртовку;

3) взять пробирку со стерильной водой в левую руку и поместить её наклонно между большим и указательным пальцем на расстоянии 3-5 см от пламени;

4) в правую руку взять петлю простерилизовать ее в пламени спиртов­ки, включая часть петледержателя, которая при работе помещается в пробир­ку;

5) мизинцем правой руки зажать пробку пробирки, повернуть, вынуть ее и держать, не касаясь окружающих предметов;

6) обжечь края пробирки и взять петлей каплю воды, поместить её на предметное стекло;

7) обжечь края пробирки и пробку. Закрыть пробирку и поставить в штатив;

8) прожечь петлю;

9) открыть пробирку с культурой так же, как в п.5;

10) стерильную петлю ввести в пробирку с культурой, охладить, при­коснувшись к внутренней поверхности пробирки, а затем взять ею небольшое количество микроорганизмов;

11) петлей с микроорганизмами сделать штрих на стекле внутри капли воды. После этого петлю прожечь и охладить, прикоснувшись к стеклу;

12) растереть штрих петлей круговыми движениями, чтобы получилась слегка опалесцирущая суспензия;

13) петлю прожечь;

14) полученную суспензию микроорганизмов накрыть покровным стеклом и микроскопировать.

Чтобы избежать в поле зрения пузырьков воздуха, нужно, расположив покровное стекло под углом 40-45°, прикоснуться им к краю капли и, когда она распределится вдоль грани, осторожно накрыть каплю.

Препарат можно подкрасить метиленовым синим (в концентрации 0,01­0,001), капнув непосредственно в препарат или поместив каплю красителя у края покровного отекла, с противоположное стороны полоску фильтроваль­ной бумаги.

При изготовлении препарата нужно учитывать размер капли, который должен быть равен приблизительно объему двух рисовых зерен.

Висячая капля. На середину необезжиренного покровного стекла нано­сят очень маленькую, с четкими краями каплю суспензии микроорганизмов, как описано выше. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лун­кой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом переворачивают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость ис­паряется очень медленно и поэтому препарат долгое время остается пригод­ным для наблюдения. Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой.

Фиксированный (постоянный) препарат готовят следующим образом:

1) приготовить суспензию микроорганизмов методом, аналогичным вышеописанному;

2) с помощью стерильной бактериологической петли распределить сус­пензию тонким слоем на поверхности предметного стекле в виде пятна диа­метром около 1 см;

3) высушить мазок на воздухе;

4) фиксировать мазок в пламени спиртовки. Для этого препарат три раза проводят в средней части пламени спиртовки. При этом микроорганиз­мы погибают, хорошо прикрепляются к стеклу, становятся более восприим­чивыми к красителю. Можно вместо термической проводить химическую фиксацию, предусматривающую применение средств, вызывающих коагуля­цию белков. В этом случае она осуществляется с помощью определенных химических веществ (например, метиловый, этиловый спирты, формалин) или различных смесей (например, уксусная кислота, абсолютный этиловый спирт и хлороформ - фиксирующая смесь Карнуа).

Для микроскопического исследования приготовленные мазки, высу­шенные и зафиксированные, подвергают окраске. Окраска бывает простая и сложная. Простая окраска заключается в нанесении на мазок какой-либо од­ной краски на определенное время. Чаще всего для простой окраски приме­няют водно-спиртовый 1:10 фуксин, метиленовую синьку и сафранин.

При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Обычно фуксином 1:10 красят 10-30 секунд, а метиленовой синькой - 2-10 минут. Фуксин и генцианвиолет окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты.

Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов.

Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бума­гой. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окра­ски.