ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Острые респираторные инфекции (ОРИ) остаются одной из важных проблем здравоохранения, особенно у детей, из-за высокого риска развития осложнений в любые сроки от начала болезни, что выдвигает эти инфекции в число наиболее актуальных в практике педиатра.

результате того, что вирусные, бактериальные патогены или их токсические субстанции, при несовершенстве факторов местной мукоцилиарной (неиммунной) и иммунной защиты, адгезируются на слизистой оболочке с первичной альтерацией респираторного эпителия. Это индуцирует развитие воспалительной реакции. К группам риска по развитию острых обструктивных заболеваний респираторного тракта - стенозирующего ларинготрахеита или ларинготрахеобронхита, относят детей с аллергическими заболеваниями: атопической аномалией конституции, пищевой и поствакцинальной аллергией, часто и длительно болеющих, сенсибилизированных предшествующими инфекциями и лекарственной терапией. [164, 147, 38]

До 70-80 годов 20 столетия многие авторы считали, что острый стенозирующий ларинготрахеит ОСЛТ (круп) возникает в остром периоде респираторной моно-вирусной инфекции и является одним из симптомов заболевания [52, 144, 145, 182, 184].

В последние десятилетия в литературе накопились данные о том, что обнаружение респираторных вирусов в верхних дыхательных путях у детей с клиническими проявлениями респираторного заболевания, так и при отсутствии таковых у практически здоровых детей, является закономерным [128, 7, 14, 27, 139] По данным ряда авторов [198, 214] респираторно­синцитиальная инфекция (РС), парагрипп 3-го и 1-го типов, грипп А и В, аденовирус, помимо самостоятельной значимости в развитии заболевания, особенно у детей раннего возраста являются прелюдией бактериального воспаления, и все тяжелые формы инфекции связаны с бактериальной флорой (нередко с гемофильной палочкой типа b).

haemolitica (грамотрицательные аэробы), которая была выделена из трахеи у 9­й месячной девочки [210, 118].

Любая условно-патогенная флора, помимо самостоятельной значимости в этиологии ОСЛТ, при длительной персистенции вызывает не только дисбиотические процессы в организме, но и способствует развитию бактериальной сенсибилизации и формированию респираторного аллергоза. Частота выявления сенсибилизации к бактериальным аллергенам у детей с заболеваниями дыхательного тракта колеблется от 20% до 40%. Также через измененные слизистые оболочки верхних дыхательных путей и кишечника происходит всасывание бактериальных эндотоксинов в кровь, что ведет к подавлению иммунологической резистентности и аллергизации [6, 15, 19, 24, 107, 171, 156].

Подтверждением тому является факт высокого уровня носительства условно-патогенной бактериальной микрофлоры, особенно среди дошкольников, посещающих детские сады и ясли, приводящий во время острой респираторной инфекции к осложнениям. Поэтому у пациентов этой возрастной категории часто имеется смешанная этиология заболеваня. В Российской Федерации по данным официальной статистики на их долю приходится около 77 % ущерба от всех инфекционных болезней [106].

В современном понимании дисбиоз не является болезнью, а представляет собой нарушение баланса микрофлоры, способное повлечь за собой ряд заболеваний.

На рубеже XX - ХХI веков сформировалось представление об экосистеме организма человека как об еще одном «органе», покрывающим в виде пленки слизистые оболочки и кожу человека. Оставаясь невидимым, этот «орган» имеет свою массу, величина которой 3-5 килограмм,

насчитывает порядка 10¹⁴ клеток микроорганизмов, что в десять раз больше числа клеток организма человека [177].

Однако, изучение спектра микроорганизмов, обитающих у человека, по настоящее время осуществляется рутинным путем посева содержимого различных органов и полостей на питательные среды, что не отражает истинной картины микробиоценоза, так как микробные сообщества живут прикрепленными к поверхности слизистых, образуя биопленки, сбалансированные по видовому составу и функциональному распределению.

По мнению проф. А.Н.Маянского полостная микрофлора (свободноживущая, или планктонная) не соответствует пристеночной биопленке, которая более стабильна и физиологична. Цитируя А.Н.Маянского в части определения дисбактериоза кишечника по фекалиям нельзя не согласиться с тем, что «Фактически это дорогостоящее (требующее тестирования в динамике), трудоемкое исследование с невысокой (если не с нулевой) отдачей».

Поэтому культуральный метод диагностики на сегодняшний день себя изжил! Почему? Да потому, что нет скрининга, врач должен определить - какую группу микробов определять и каким методом: посев на грибы, на аэробы, анаэробы, на метаболиты. А если необходимо исследовать материал на наличие хламидий, вирусов, микобактерий туберкулеза, то необходимо обращаться в специализированную лабораторию. При этом вероятность выявления реального патогена мала по той причине, что его пытаются выявить в стерильной среде - моче, крови, ликворе, гное, экссудате - жидкостях, которые имеют развитую антигенную систему, а гипотетически в них не должны быть жизнеспособные микроорганизмы. При тестировании резистентности клинического штамма in vitroвозникает ряд трудностей: выделенный штамм редко является истинным или единственным агентом воспаления, чувствительность к антибиотикам in vivo,как известно, далека от чувствительности в чашке Петри. Точнее - микробное сообщество в

состоянии биопленки при quorum-sensingигнорирует любые самые сильные антибиотики. [189].

Согласно данным акад.А.А. Воробьева(2010г.), инфекция патологически (клинически) значимой считается в случае инфицирования органа, в котором возникает биопленка микробных клеток (КОЕ>10³) для возникновения quorum sensing - обобщение генетической, трофической, энергетической, токсической, патогенетической активности микробного сообщества.

К сожалению, в повседневной практике врача не доступны вышеуказанные способы верификации возбудителя заболевания. Тем не менее, в век доказательной медицины и современного представления об экосистеме организма назрела необходимость в более широком применении высокотехнологичных методов диагностики.

Наше внимание привлек метод молекулярной диагностики, который появился в России в начале 90-х годов XX века. Данный метод диагностики основан на выявлении спектра микроорганизмов в различных объектах по специфическим для них химическим веществам - маркерам из числа жирных кислот, альдегидов и стеринов, входящих в состав их клеточной стенки. Метод детектирования микроорганизмов по жирным кислотам или метод газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией сродни генетическому (ПЦР, определение последовательности нуклеотидов 1€?sl³I ІК и пр.), поскольку состав жирных кислот детерминирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РІК и последующего синтеза ЖК в митохондриях по матричным РІК. [87, 102].

В этом принципиальное отличие метода ГХ-МС микробных маркеров, придающее ему качественно новое свойство - возможность разложения суперпозиции всего пула микробных маркеров, что позволяет оценить вклад от каждого из сотен видов микроорганизмов, которые обитают, например, в кишечнике. Метод является высокочувствительным, быстрым (2,5 ч на пол­ный цикл исследования), универсальным, экономичным и имеет широкий диагностический спектр. Внедрение ГХ-МС дает возможность сократить время и стоимость исследования, минуя стадии повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны, трудоемки и длительны для анаэробов. Метод позволяет не только определять маркерные вещества (жирные кислоты, альдегиды, спирты и стерины) в чистых культурах микроорганизмов, выделенных из клиниче­ского материала по известной технологии, но и количественно устанавливать состав микробного сообщества, который кроется за набором маркеров конкретной пробы [95, 103, 196, 179, 135, 161, 95].

Учитывая малую информативность результатов рутинных бактериологических методов этиологической расшифровки

бактериальных осложнений у детей с респираторными инфекциями, протекающих с обструкцией верхних дыхательных путей (стенозом гортани), в настоящее время назрела необходимость использования современных высокотехнологичных методов диагностики, позволяющих с большей достоверностью судить об этиологии острых респираторных заболеваний, протекающих с ОСЛТ в вариантах затяжного течения и рецидивов обструкции гортани. Все это определяет актуальность настоящего исследования.

Цель и задачи исследования

Цель исследования: изучение этиологии ОСЛ (крупа) с помощью современных методов диагностики, позволяющих оценить состояние организма как единую экосистему, для углубления представления о роли бактериальной инфекции и факторов её патогенности на течение заболевания и обоснования своевременного назначения этиотропной терапии.

Задачи исследования:

1. Изучить новое направление в молекулярной микробной диагностике для

выявления микст-инфекции, дисбиозов и воспалительных процессов по специфическим маркерам (жирным кислотам, альдегидам и стеролам) с помощью хромато-масс-спектрометрии в крови, слюне у детей с ОСЛ (крупом).

2. Изучить частоту встречаемости вирусно-бактериальных ассоциаций при

ОСЛ (крупе) у детей.

3. Определить характер микрофлоры верхних дыхательных путей с учетом факторов патогенности бактериальной флоры.

4. Разработать диагностический алгоритм ОСЛ(крупа) вирусной и бактериальной этиологии заболевания по ведущим клиническим признакам с позиций доказательной медицины и решить вопрос о своевременном назначении этиотропной терапии.

5. Оценить эффективность системной антибактериальной терапии и препаратов, усиливающих этиотропную терапию у детей с ОСЛ (крупом).

Научная новизна:

1. Впервые у детей с ОСЛ (крупом) изучена этиология заболевания по результатам выделения микроорганизмов из слюны и крови с помощью метода газовой хроматографии - масс-спектрометрии.

2. Впервые показано, что организм ребенка представляет собой единую экосистему. Для выявления этиологического фактора можно

ориентироваться на показатели какой-либо одной среды, избегая инвазивные методы диагностики.

3. Впервые показано, что в этиологии ОСЛ (крупа) у детей всегда присутствует микст-инфекция. Бактериальная флора представлена в основном колонизацией актиномицетов и анаэробов. Респираторные вирусы выделяются у всех детей в остром периоде заболевания методом ПЦР.

4. Впервые у детей с ОСЛ (крупом) проведена оценка формы тяжести заболевания с помощью ЛИИ и ЯИИ.

5. Впервые предложено лечение детей с ОСЛ (крупом) с бактериальными осложнениями не только антибиотиками, но и препаратами, усиливающими этиотропную терапию.

Практическая значимость. Результаты настоящего исследования показали, что у детей с ОСЛ(крупом) в этиологии заболевания часто имеет место микст-инфекция. На сегодняшний день, при наличии у детей с ОСЛ (крупом) признаков вероятной вирусно-бактериальной инфекции, можно с уверенностью сказать, что у них превалирует бактериальная этиология заболевания. И даже если врач сомневается в необходимости назначения антибактериального препарата, то лучше его назначить до получения объективных данных бактериальной инфекции. В дальнейшем при отсутствии клиники и лабораторных признаков бактериальной инфекции антибиотик можно отменить (не проводить так называемый «курс» по 7 и более дней), что снижает устойчивость микроорганизмов. Врачам амбулаторной сети с целью предупреждения бактериальных осложнений необходимо усилить объем лабораторного обследования, выполнять протокол лечения при ОРВИ и гриппе, особенно у детей раннего возраста. У детей с ОСЛ (крупом) с бактериальными осложнениями при отсутствии положительной динамики в течение заболевания эмпирический выбор антибиотиков должен быть из группы линкозамидов, ингибиторзащищенных

пенициллинов, цефалоспоринов III-IV поколений, гликопептидов, так как основными представителями бактериальной флоры являются аэробные актиномицеты и анаэробы. В работе показана эффективность этиотропного антибактериального препарата Роксигексал, влияющего на купирование основных симптомов заболевания. Критериями лечения явилось наличие эрадикации патогенов. Обосновано использование в терапии препаратов, интенсифицирующих этиотропную терапию, влияющих на гомеостаз организма, в частности препарата Вобэнзим.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У детей с ОСЛ (крупом) этиология заболевания в настоящее время представлена микст-инфекцией. Бактериальная флора представлена колонизацией анаэробов в 50% случаев наблюдения, актиномицетов в 20%, другие аэробы составили 30%, из них возбудители, выявляемые в бактериологических лабораториях, составили 15,6%. Преимущественной колонизацией обладают Streptococcus, Nocardia, Streptomyces и другая условно-патогенная флора.

2. В выявлении генеза ОСЛ (крупа) можно ориентироваться на показатели какой-либо одной среды, избегая инвазивные методы диагностики, так как организм ребенка представляет собой единую экосистему.

3. У детей с ОСЛ (крупом) всегда присутствует микст-инфекция. Бактериальная флора представлена в основном колонизацией актиномицетов и анаэробов. Респираторные вирусы выделяются у всех детей в остром периоде заболевания методом ПЦР.

4. Данный факт патогенетически обосновывает назначение этиотропной терапии, а также препаратов, усиливающих их действие у детей с ОСЛ (крупом) для нормализации микрофлоры и восстановления мукозальной защиты.

Внедрение в практику Результаты исследования внедрены в практику работы Морозовской детской городской клинической больницы, рекомендуются для широкого использования в практическом здравоохранении. Основные положения работы используются в практике лекционного курса и семинарских занятий на кафедре инфекционных болезней у детей №1 педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздрава России.

Апробация диссертации. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на совместном заседании научно-практической конференции сотрудников кафедры инфекционных болезней у детей №1 педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России и сотрудников отделений ГБУЗ Морозовской ДГКБ ДЗМ.

Основные результаты работы доложены на заседании инфекционной секции Московского отделения Союза педиатров России (г. Москва, 2010,2011гг.) и на IX-X конгрессах детских инфекционистов России (г. Москва, 2010-2011гг).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе статей в ведущих рецензируемых научных журналах рекомендованных ВАК к изданию.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на _______________ страницах машинописного текста,

содержит 3 выписки из историй болезни, ___ таблиц, ___ рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 172 отечественных и 54 зарубежных источников.