1.2.1. ОНКОГЕНЫ ИММОРТАЛИЗАЦИИ
Принято считать, что именно с иммортализации (бессмертия, т. с. приобретением клетками способности бесконечно пролиферировать) начинается процесс канцерогенеза независимо от его природы (вызванный онкогенами вирусов, химическими канцерогенами, радиацией или при спонтанной ма- іигнизации in vitro).
В нормальных тканях, как известно, с развитием дифференцировки, т. е. с повышением их специаіизации и снижением плюрипотентности, всегда прогрессивно снижается способность их клеток к митозу, что обычно выражается пределом Хэйфлика (наиболее плюрипотентная эмбриональная клетка живет не более 50 делений). Клетки же с активированными генами иммортализации приобретают как минимум три основных свойства, инициированных этими генами. Во-первых, они постоянно пролиферируют, т. е. для них не существует ограничений, обусловленных пределом Хэйфлика, — продиферативно они бессмертны. Во-вторых, у них блокирован процесс конечной дифференцировки. В-третьих, они могут вступить в процесс промоции, индуцированный химическим промотором {Connan G. et al., 1985; Glaichenhaus М. et al., 1985; Coppolla J. A., Cole M. D., 1986; Garrett С. T., 1986; Klein G., Klein E., 1986). Например, четко показано, что онкоген c-myc или v-myc, приводя клетки к состоянию иммортализации, полностью блокирует их дифференцировку и такие клетки приобретают способность постоянно пролиферировать независимо от наличия ФР [Falcone G. et al., 1985; Rapp U., 1985; Dmitrovski E. et al., 1986; Clarke M. F. et al., 1988; Coppolla J. A. et al., 1989).Следовательно, первая стадия канцерогенеза — стадия инициации обусловливается стабильной активацией генов иммортализации (протоонкогенов) или же интеграцией в клеточный геном экзогенных онкогенов иммортализации опухолсродных вирусов. Ее главным выражением является имморта-
лизация клетки, геном которой при этом приобретает способность вступать во вторую стадию канцерогенеза — промоцию.
Иными словами, инициированная клетка с активированными или итерированными (вирусными) генами иммортализации хотя и приобретает способность бесконечно пролиферировать, тем нс менее еще не имеет фенотипическую характеристику неопластически трансформированной клетки. Иммортализированные клетки не ту- морогенны, т. е. не способны при трансплантации изологичным животным или особям с иммунодепрессией вызывать опухоли (не растут в системе in vivo).К генам иммортализации (или инициации) можно отнести myc, ген р53, ген большого Т-антигена вируса полиомы pit и SV40, ранний ген аденовирусов EIA [Glfichenhaus М. et al., 1986; Linder S., Marshall H., 1990]. Общим для этих генов является то, что они кодируют ядерныс белки, связывающиеся с ДНК и ядерным матриксом, и то, что активация их осуществляется с помощью механизмов, не изменяющих нуклеотидную последовательность кодирующего участка гена, т. е. посредством амплификации, присоединения к сильному промотору и метилирования (Агеенко А. И., 1986; Eisenman R. N. et al., 1985; Lee W. M. et al., 1985; Garrett С. T., 1986; Klein G„ Klein E., 1986; Martin P., 1986]. Таким образом, иммортализирующий эффект этих генов обусловливается чаще их неизменным продуктом — ядерным онкобелком. Учитывая это, можно предположить, что к генам иммортализации также относятся и другие онкогены, кодирующие ялерные белки, а именно myb, fos, ets, jun и ski |Klempnauer К. A., Sippel A., 1987; Halazonetis T. D. et al., 1988; Abate C. et al., 1989]. Короткоживущис ядсрные белки — продукты генов v- myb и c-myb — участвуют в процессах, влияющих на рост и дифференцировку клеток многих типов. Интактные белки — продукты генов v-myb и c-myb также могут активировать транскрипцию посредством myb-связывающего участка, локализованного между остатками 204 и 254 [Weston К., Bishop J., 1989]. Установлено, что v-myb-N-концевой повтор онкобелка p48vroyb необходим для трансформации [Ibanez С. Е., Lipsik J. S., 1988]. Идентифицирован также С-концевой домен p48v myb, необходимый для роста трансформированных v-myb миелобластов в мягком агаре, но не для морфологической трансформации.
Трансформирующие белки jun и fos формируют белковый ДНК-связыва- ющий комплекс (гетсродимср), который, специфически взаимодействуя с регуляторным элементом транскрипции у млекопитающих (АР-1 + связывающий участок jun-бслка), оказывает прямое влияние на транскрипцию [Abate С. et al., 1989; Meinkoth J. et al., 1989; Storms R. W., Bose H. R., 1989]. Важно, что белки fos и Fra (еще два белка Fos-related antigens) обеспечивают длительное увеличение общей связывающей ДНК активности фактора транскрипции АР-1 [Sonnenberg J. L. et al., 1989]. Обнаружена положительная регуляция jun АР-1 под действием продуктов онкогена Е1А аденовирусов [De Groot R. et al., 1991]. Установлено, что АР-1-связывающие сайты продукта протоонкогена c-fos могут опосредовать индукцию эпидермальным ФР и 12- о-тетрадеканол-форбол-13-ацстатом [Fisch Т. М. et al., 1989]. Весьма существенно, что АР-1 активирует промотор гена коллагеназы типа IV, который, как оказалось, высокогомологичен промотору полиомавирусов. Очевидно, это один из путей в иммортализированных клетках экспрессии злокачественного фенотипа.
В. Quatin и R. Breathnach (1988) обнаружили, что эпидермальный ФР сти
мулирует транскрипцию гена c-jun и это есть первичный ответ клеток. Эти данные подтверждают гипотезу, согласно которой усиленная экспрессия генов, кодирующих факторы транскрипции, является важным элементом в механизме передачи сигнала, что и обеспечивает длительный транскрипционный ответ клеток на ФР. На системе миелоидных клеток показано, что индукция экспрессии генов c-fos и c-jun под действием src-гена или сыворотки приводит к транскрипционной активности гена (51-ТФР (Brichenall- Roberts М. et al., 1990]. При этом белок рр60*гс мог «заменять» потребность в сыворотке путем стимулирования связывания с АР-1-комплексом (51-ТФР- промотора, опосредованно вызывая тем самым индукцию транскрипции (51- ТФР. Следовательно, продвижению сигналов, приводящих к изменению активности гена, благоприятсвуют продукты онкогена, в частности, ФР или их рецепторы.
Белки jun и fos, как это было продемонстрировано, активируют транскрипцию ієна в ответ на стимуляцию клеток. Наряду с этими белками в активации онкогенов участвуют ФР и другие стимуляторы (например, нервный импульс, который действует через белки jun и fos) (Marx J. L., 1988].В отношении онкогена jun следует напомнить, что этот ген был открыт в 1986 г. у вируса 17 саркомы птиц (название происходит от японского слова ju — папа, что означает 17), вызывающею фибросаркомы у цыплят. Белок jun действует совместно с белком fos. Ген вирусного белка v-jun характеризуется отсутствием нуклеотидной последовательности, кодирующей 27 аминокислот, которая содержится в клеточном белке jun. Вирусный ген v-jun имеет несколько мутаций, являющихся следствием замещения аминокислот. В зараженных вирусом клетках всегда наблюдается свсрхэкспрессия вирусного белка jun, избыток которого и приводит к неопластической трансформации. Идентифицированы родственные онкої ены jun В и jun D. Очевидно, существует семейство генов jun. Ген jun D кодирует белок, который на С’-конце молекулы имеет область, узнающую ту же последовательность ДНК, что и продукт гена клеточного белка c-jun (РЕА1/АР-1 или чувствительный к ко- канцерогену элемент). Оба белка способны к трансактивации, однако в отличие от генов c-jun и jun В трансактивация гена jun D не усиливается под действием сыворотки и ТФР [Иігаі S. I. et al., 1990; Vogt P., 1992]. Дія преобразования гена jun в активный онкоген необходимы два изменения; деления аминокислотной проксимальной области и удаление З'-нетранслируемой последовательности, вызывающей нестабильность мРНК. Помимо активации транскрипции генов, онкоген jun стимулирует синтез ДНК.
Следует обратить внимание на то, что амплификация не всегда сопровождается пропорциональным повышением уровня транскрипции. Это указывает на транскрипционную некомпетентность некоторых онкогенов, в частности гена c-myc [Nepven A. et al., 1985]. Иногда происходит повышение уровня транскрипции с-тус в нетрансформированных клетках (например, в покоящихся фибробластах) и регулируется постгранскрипцинно ФР (Blanchard J.
М. et al., 1985].С помощью компьютерного анализа идентифицированы сходные по первичной и вторичной структуре участки большого Т-антцгена SV40, Е1А- белка аденовируса и онкобелков с-тус и v-myc [Figge J. et al., 1988; Moran E., 1988]. Во всех случаях эти последовательности нуклеотидов были локализованы в доменах, ответственных за трансформацию. Авторы считают, что структурное сходство выявленных участков онкобелков коррелирует с общей биологической функцией (реіуляция клеточного деления), присущей данным белкам.
Показано, что экспрессия генов иммортализации (c-myc, v-myc, pit — ген большого Т-антигена SV4O и ген Е1А аденовирусов) вызывает в клетках генетическую нестабильность на хромосомном и молекулярном уровнях, приводящую к резкому возрастанию уровня сестринских хроматидных обменов (СХО), а также к увеличению числа клеток с измененным кариотипом (Сеті С. et al., 1986; Leopold Р. et al., 1986]. В неопластически трансформированных клетках, т.е. когда начинают функционировать онкогены, обусловливающие опухолевый фенотип (ras или pmt), уровень СХО сравним с таковым в нормальных клетках. Полагают, что клетки с резко нестабильным геномом постепенно элиминируются из популяции.
Предпринимаются дальнейшие попытки определения молекулярных механизмов иммортализации клеток человека. Например, J. W. Shay и соавт. (1991) постулируют существование двух различных стадий (Ml и М2), которые необходимо преодолеть клеткам для того, чтобы прогрессировать не по программе нормального старения, а стать бессмертными. Приводятся данные о том, что в некоторых случаях потери функций антионкогенов Rbl и р53 моїут быть двумя событиями, необходимыми для преодоления стадии М-1 в фибробластах человека, хотя не было показано непосредственное участие этих двух генов. Предполагается, что иммортализация клеток человека продуктами гена pit вирусов полиомы и SV40, ранним белком ЕА1 аденовирусов и белками Е6 и Е7 вируса папилломы человека типа 16 (HPV 16) может быть вызвана отчасти обходом стадии Ml путем удаления Rbl- и р53-генных продуктов. Генетическая нестабильность и другие факторы также могут способствовать инактивации М2-мсханизмаи последующей индукции иммортализации.
Установлено также, что онкоген v-rel иммортализует лимфоидные клетки цыплят и v-abl-лимфоциты мышей, но не один из этих двух онкогенов не делает «бессмертными» фибробласты. Продукты генов вируса Эпштейна- Барр — мембранные белки EBNA-1 и EBNA-2 — эффективно иммортализу- ют В-лимфоциты человека |Sugdcn В., 1989].
Итак, иммортализация клетки необходима, но недостаточна для ее превращения в опухолевую, т. е. для завершения процесса онкогенеза и, следовательно, инициированная клетка (с активированным клеточным или интегри- рованным вирусным онкогеном иммортализации) еще не приобретает фенотипической характеристики опухолевой клетки {Garrett С. Т., 1986; Graf Т. et al., 1986; Klein G., Klein E., 1986; Nambu M. et al., 1986].