Оценка экспрессии мРНК генов цитокинов
Выделение суммарной РНК клетки (общей РНК)
Выделение общей РНК из клеток производилось с использованием набора для выделения общей РНК «RNeasy Mini kit» («Qiagen», США).
Непосредственно перед выделением готовили лизирующий буфер из расчета 350 мкл буфера RLT на IO5 клеток с добавлением 10 мкл Р-меркаптоэтанола на 1 мл буфера RLT.
Суспензию моноцитов центрифугировали при 300g в течение 5 минут при комнатной температуре. Добавляли 350 мкл буфера RLT с Р-меркаптоэтанолом на IO5 клеток и гомогенизировали, пропуская лизат через иглу 21G1/2 (диаметр 0,85 мм) не менее 10 раз. Добавляли 350 мкл 70% этанола, после чего лизат тщательно перемешивали. По 700 мкл лизата переносили в разделительные колонки, помещенные в пробирки на 2 мл и центрифугировали при 8000g в течение 25 секунд. Жидкость, профильтрованную через разделительные колонки, отбрасывали. Далее добавляли 700 мкл буфера RWl (входит в набор для выделения) в разделительные колонки, помещенные в 2 мл пробирки (разделительные колонки и пробирки входят в набор для выделения) и центрифугировали при 8000g в течение 25 секунд. Жидкость, профильтрованную через разделительные колонки, отбрасывали. Далее 500 мкл буфера RPE (входит в набор для выделения) добавляли в разделительные колонки, помещенные в 2 мл пробирки, и центрифугировали при 8000g в течение 25 секунд. Жидкость, профильтрованную через разделительные колонки, отбрасывали. Операции от добавления буфера RPE до отбрасывания жидкости повторяли еще один раз. Разделительные колонки, помещенные в 2 мл пробирки, центрифугировали при 8000g в течение 2 минут. Переставляли разделительные колонки в новые 2 мл пробирки и центрифугировали при 14500g в течение 60 секунд. Разделительные колонки переносили в 1,5 мл пробирки и добавляли 30 мкл раствора для элюции РНК с разделительных пробирок. Разделительные колонки, помещенные в 1,5 мл пробирки, центрифугировали при 8000g в течение 60 секунд.В итоге получали общую РНК в составе раствора в 1,5 мл пробирках.
Синтез комплементарной ДНК (кДНК)
Для синтеза комплементарной ДНК использовали набор реактивов «Promega» (США). В эппендорфы на 200 мкл вносили по 15 мкл «смеси 1» из расчета на один образец: 2 мкг РНК, 0,5 мкг гексамерных олигонуклеотидов («Promega», США). Образцы инкубировали при температуре 700C в течение 5 минут, затем при 4°С в течение 10 секунд.
Готовили «смесь 2» из расчета на один образец: 0,5 мкл MMLV RT («Promega», США) в концентрации 200 ед/мкл, 8 мкл буфера для MMLV RT («Promega», США), 1,25 мкл дНТФ (10 мМ), 15,25 мкл дистиллированой воды. Перемешивали, после чего добавляли по 25 мкл «смеси 2» в эппендорфы со «смесью 1». Эппендорфы помещали в амплификатор («Applied Biosystems», США), где инкубировали по программе: 60 мин при 37°С, 15 мин при 70°С, остановить на 4°С. Замораживали к ДНК при -20°С до последущего анализа.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени
Подбор праймеров производили с использованием программы IDT’sPrimerQuest, находящейся в свободном доступе в сети Интернет (http://idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/). Для амплификации ДНК использовали следующие праймеры: ILlB, прямой праймер: 5’-ATCTGT ACCTGTCCTGCGTGTT-3', обратный: 5-TCTGCTTGAGAGGTGCTGATGT- з’; шб, прямой праймер: S-TgaaagcagcaaagaggCACTG-S', обратный: 5'-TTTCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3’; IL8, прямой праймер: 5'-TCAG AGAC AGC AGAGC AC AC АА-3', обратный: 5 '-GGCC AGCTTGG AAGTC ATG ТТТ-3’; IL10, прямой праймер: 5’-TGCCTTCAGCAGAGTGAAGACT-3’, обратный: 5’-TCTGGGTCTTGGTTCTCAGCTT-3'; IP10, прямой праймер: 5’- CTGCCATTCTGATTTGCTGCCT-3', обратный: 5'-TGATGCAGGTACAGCGT ACAGT-3’; FGFB, прямой праймер: 5’-ATGGTCCCTCTAACTGGGCTTT-3', обратный: 5'-AAGTGGTAGAGGAAGGCAGCTT-3’; TGFB, прямой праймер: 5-AATTCCTGGCGATACCTCAGCA-3', обратный: 5'-AAGGCGAAAGCCCT СААТТТСС-3'; VEGF, прямой праймер: 5'-GGGCAGAATCATCACGAAG TG-3', обратный: 5'-ATTGGATGGCAGTAGCTGCG-3'; А1-аденозиновый рецептор, прямой праймер: 5'- CTACTTCCACACCTGCCTC-3', обратный: 5'- GTCACCACCATCTTGTAC-3'; A2A - аденозиновый рецептор, прямой праймер: 5'-GAGCTCCATCTTCAGTCCCC3', обратный: 5'-GCATGGGAGTC AGGCCGATG-3'; А2В - аденозиновый рецептор, прямой праймер: 5'-GTCGA CAGATACCTGGCCАТС-3', обратный: 5'-CAGTTGTTGGTGGCACTGTC-3'; АЗ-аденозиновый рецептор, прямой праймер: 5'- GTTGTCCGCAAG GCTGACC-3', обратный: 5'-CAAATGACTGATTACAGAG-3'; Р-актин, прямой праймер: 5'-CGCCCCAGGCACCAGGGC-3', обратный: 5'-GGCTGG GGTGTTGAAGGT-3' («ГОТ», США).
Для проведения ПЦР использовали «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I» (ООО «НПФ «Синтол», Россия), согласно инструкции производителя. Реагенты и пробы кДНК размораживали, перемешивали на вортексе и откручивали на миницентрифуге. Для построения калибровочной кривой готовили разведения кДНК (10"1, IO"2, IO"3, IO"4). В каждую лунку планшета раскапывали по 4 мкл смеси прямого и обратного праймеров, 1 мкл ДНК, 2 мкл деионизованной воды. Далее готовили реакционную смесь для каждого гена в расчете на 1 образец: 2,5 мкл IOx ПЦР-Буфера, 2,5 мкл дНТФ (2,5мМ), 2,5 мкл MgCC (25мМ), 0,5 мкл Taq ДНК-полимеразы (5ед/мл), 10 мкл деионизованной воды. По 18 мкл готовой реакционной смеси раскапывали в каждую лунку. Общий объем реакционной смеси в лунке, таким образом, составлял 25 мкл.
Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили на детектирующем термоциклере ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия). Устанавливали следующую смену температурных режимов: 2 минуты при 50°С, 2 минуты при 93°С; далее - 45 циклов (15 секунд при 93°С, 1 минута при 60°С); 100 циклов по 15 секунд при 90°С. После завершения всех циклов прибор переходил в режим сохранения данных при IO0C. Уровень экспрессии мРНК цитокинов выражали по отношению к экспрессии мРНК 13- актина. Для обработки данных по экспрессии генов использовали AACt - метод.
2.3.4