Оценка цитокинового профиля моноцитов
Определение базального и стимулированного NECA уровней секреции цитокинов IP-10, PFGF, TGFp, VEGF, IL-IР, IL-6, IL-8, IL-10 в кондиционной среде культур моноцитов проводили методом неконкурентного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем «R&DSystems» (США) согласно инструкции производителя.
Образцы супернатантов хранили при -20°С. Перед началом работы реагенты и образцы прогревали до комнатной темепературы (18 - 25°С). Перед проведением анализа подготавливали все необходимые реагенты, а также разведения стандартных и исследуемых образцов согласно инструкции производителя.
Метод определения концентрации цитокинов основан на твердофазном «сэндвич» - варианте ИФА. На первом этапе анализа специфические иммобилизованные первичные антитела к исследуемому цитокину, адсорбированные на лунках микропланшета, должны были связаться с цитокином в образце. Поэтому в ходе исследования добавляли в лунки планшета разведенные стандартные, исследуемые и контрольные образцы. После чего заклеивали планшет клейкой лентой и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Далее удаляли из лунок несвязавшиеся компоненты. Для этого по истечении времени инкубации аспирировали содержимое лунок и промывали промывочным буфером (400 мкл) 4 раза с помощью полуавтоматического промывателя планшет. После промывки удаляли остатки жидкости из плашек.
На втором этапе связавшийся цитокин исследуемого образца взаимодействововал с антителами связанными с биотином. Для этого в каждую лунку добавляли 200 мкл антител меченных биотином, заклеивали клейкой лентой и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. По окончании времени инкубации для удаления несвязавшихся компонентов аспирировали содержимое лунок и промывали промывочным буфером с помощью полуавтоматического промывателя планшет, после чего удаляли остатки жидкости из плашки.
На третьем этапе биотин на связавшихся антителах взаимодействовал с комплексом стрептавидина с пероксидазой хрена. В ходе анализа на данном этапе во все лунки вносили по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена, и инкубировали 20 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Далее промывали лунки как описано выше.
На четвертом этапе количество связавшегося стрептавидина определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена - тетраметилбензидина. Поэтому во все лунки добавляли 100 мкл раствора субстрата (содержащего перекись водорода и тетраметилбензидин), инкубировали 20 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте.
На заключительном этапе реакцию останавливали стоп-реагентом (2N H2SO4). В ходе анализа на данном этапе вносили 50 мкл стоп-реагента во все лунки, после чего цвет изменялся с голубого на желтый. Далее в течение 30 минут проводили измерение оптической плотности образцов при длине волны 450 нм (референсная длинна волны 540/570 нм) на планшетном фотометре Multiscan EX («Thermo Scientific», Германия). Построение калибровочной кривой и обсчет данных проводили с помощью программного обеспечения «GraphPad Prizm5».
2.3.5