Микробиологическая диагностика инфекции глаз

Микробиологическое обеспечение имеет большое значение для диагностики, профилактики и лечения инфекционной патологии глаз [34, 58]. Оно предназначено для решения следующих задач.

1. Установление инфекционной природы заболевания (этиология процесса).

2. Выявление возбудителя, его родовой и видовой принадлежности (микробиологическая диагностика).

3. Определение чувствительности возбудителя инфекции к антимикробным препаратам.

Микробиологические исследования необходимы также для эпидемиологического и санитарного контроля. Последнее сегодня важно для предупреждения осложнений, связанных с распространением госпитальных штаммов микроорганизмов.

Решение задач микробиологического обеспечения лечебного процесса в офтальмологии возможно только при тесном контакте клинициста и микробиолога.

Задачи клинициста (лечащего врача, хирурга).

1. Определяет адекватное для забора биоматериала время (момент взятия) для последующего посева, исключающее воздействие антимикробного или иного лечения на результат микробиологического исследования.

2. Обеспечивает асептическое взятие биоматериала для исключения или максимального ограничения обсеменения пробы посторонней микрофлорой (с непораженных участков глаза и кожи).

3. Проводит забор материала в количестве, достаточном для микробиологического исследования.

4. Осуществляет в необходимых случаях забор контрольных проб (обычно мазков с непораженных участков конъюнктивы) для посева и последующего сравнения с результатом анализа биоматериала из очага воспаления.

5. Обеспечивает передачу материала для микробиологического исследования в максимально короткие сроки.

6. При необходимости транспортировки или хранения биоматериала производит его посев в транспортные среды или помещает в транспортные системы.

7. Производит посев биоматериала на базовые питательные среды, обеспечивает передачу в микробиологическое подразделение.

8. Обеспечивает микробиологическую службу всей необходимой клинической информацией, что позволяет избирательно проводить бактериологический анализ, вести целенаправленный поиск возбудителя.

Микробиологическая служба осуществляет следующие основные функции.

1. Производит посев биоматериала на все необходимые для полноценной диагностики питательные среды.

2. Осуществляет в полном объеме комплекс исследований, позволяющий установить родовую и видовую принадлежность микроба, в доступных случаях — его патогенность.

3. Сравнивает микрофлору опытной и контрольной проб и определяет круг микроорганизмов, которые могут рассматриваться как возбудители инфекционного процесса.

4. Определяет чувствительность микроорганизмов к антимикробным препаратам. С учетом тяжести поражения глаз выбирает и использует наиболее информативный метод определения.

5. В особых клинических ситуациях определяет иные характеристики терапевтического потенциала антимикробных лекарственных средств (бактерицидное действие, сочетанное действие и др.).

6. Систематически (поэтапно) информирует лечащего врача о предварительных результатах микробиологических исследований вплоть до составления окончательного заключения.

7. В необходимых случаях ведет динамическое наблюдение за микрофлорой пораженного глаза и ее чувствительностью к антибиотикам для коррекции антимикробного лечения.

8. На основе систематического мониторинга чувствительности микроорганизмов — возбудителей патологии глаз к антимикробным препаратам разрабатывает рекомендации для эмпирической антибиотикотерапии в отдельном клиническом подразделении (офтальмологическое отделение, специализированные клиника или стационар).

Значение взаимодействия клинициста и микробиолога для осуществления эффективного и качественного бактериологического исследования во многом связано с особенностями офтальмологической клиники. Забор материала для посева — соскоб, мазок, аспирация, биопсия — может осуществлять только клиницист, причем достаточной квалификации.

Перед лечащим врачом стоит ответственная задача — правильно оценить время взятия биоматериала для посева. Биоматериал не должен содержать антимикробного соединения или его концентрация должна быть сведена к минимальной. Следовательно, перед взятием материала для посева необходимо исключить местное применение лекарственных средств, содержащих антимикробный компонент, по меньшей мере за 6 часов до процедуры. Если клиническая ситуация позволяет, этот период должен быть увеличен до одних суток. Больной может получать антибиотики внутрь или парентерально. В этой ситуации следует последнее введение антибиотика провести таким образом, чтобы в момент взятия субстрата для посева концентрация антибиотика в тканях была минимальной. Для разных антимикробных препаратов этот период различен. Для бета-лактамных антибиотиков (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, монобактамы) — не менее 12 часов, для аминогликозидов, тет- рациклинов, макролидов — до одних суток.

Очень важно минимизировать промежуток времени между забором биоматериала и посевом. Многие облигатно анаэробные бактерии при контакте с атмосферным кислородом гибнут в течение 10-30 минут. Другие, так называемые «требовательные» бактерии, теряют жизнеспособность в течение нескольких часов. В офтальмологической практике этому способствуют скудность посевного материала, его быстрое подсыхание. Мировая практика говорит о целесообразности овладения клиницистами, проводящими забор биоматериала, простейшими микробиологическими приемами, позволяющими сохранить жизнеспособность микроорганизмов. Это необходимо, если микробиолог не участвует в процедуре взятия проб, что в отечественной практике случается достаточно часто.

Если в силу особых обстоятельств проба не может быть незамедлительно передана в микробиологическую лабораторию, то, будучи в транспортной системе (транспортной среде), она может храниться в холодильнике при 2-8°С в течение 2 часов и лишь в исключительных случаях — 8 часов. Более поздний посев, как правило, малоинформативен или, хуже того, способен дать ошибочный результат, дезориентирующий лечащего врача. Посевы на питательные среды общего назначения, сделанные лечащим врачом, передают в микробиологическую лабораторию для инкубации при температуре 30-37 °С; ее можно проводить в любом подразделении, где есть термостат с адекватными температурой и санитарным состоянием.

Грамотный микробиологический анализ может быть проведен только в том случае, если клиницист передает бактериологу всю необходимую информацию о больном и субстрате, направленном на исследование. Что направлено, каким образом получен материал, когда он взят (с указанием даты, часа и минут), объем пробы, наличие контрольной пробы. Очень важен диагноз — достоверный или предположительный. Бактериологический анализ при стафилококковом, гонококковом, туберкулезном или ином процессе будет иметь существенные различия: другой набор питательных сред, специальные методы окраски и т. п. Поэтому, если клиницист предполагает особый характер инфекционного поражения глаз, если есть анамнестические указания на такую возможность, микробиолог должен быть об этом информирован: это сделает исследование более точным и сократит сроки его выполнения (в ряде ситуаций весьма существенно).

Микробиологическая диагностика инфекционной патологии глаз является сложной проблемой в силу многообразия этиологических факторов [13, 45, 58].

Перечень наиболее распространенных и часто используемых в отечественной и зарубежной практике питательных сред именно при гнойной патологии различной локализации, в том числе глаз, представлен в приложении 4. Зарубежный опыт имеет ряд отличий, которые важно учитывать при бактериологической диагностике заболеваний глаз. Среды заметно богаче источниками белкового питания, они многокомпонентны (колумбийский агар, сердечномозговой агар и бульон, казеиново-соевый агар и бульон и др.). Важно, что в мясных средах не принято использовать заменители качественного мяса. Особое внимание уделено средам для выделения облигатно анаэробных бактерий. В них учтены высокие ростовые требования этих микроорганизмов к источникам азота, углерода, витаминов, к поддержанию рН и редокс-потенциала в строго определенных рамках. В зарубежных питательных средах большое внимание уделено селективным добавкам, позволяющим сократить время исследования и облегчить дифференциацию бактерий. Большинство названных в таблице питательных сред доступны отечественным микробиологам и выпускаются отечественными производителями.

Правильное последовательное использование питательных сред может иметь решающее значение для бактериологической диагностики. Принципиальная схема этого процесса представлена на рис. 156.

Рис. 156. Принципиальная схема использования питательных сред в клинической микробиологии [23].

Естественно, что схема может меняться, расширяться и сокращаться в зависимости от ростовых требований и доступности возбудителя.

Эндофтальмит. При гнойном поражении глаза после оперативного вмешательства (послеоперационный эндофтальмит) наиболее часто выделяют стафилококки, цепочковые кокки (стрептококки, пневмококки), палочки синезеленого гноя, пропионибактерии. При посттравматическом эндофтальмите, помимо золотистого стафилококка и цепочковых кокков, выделяют спорообразующие грамположительные бактерии (B. cereus) и патогенные клостридии, реже кишечные палочки и псевдомонады. При эндофтальмите как осложнении септических процессов (сепсис, тяжелая инфекция иной локализации), особенно у больных с нарушенным иммунитетом, обнаруживают золотистые стафилококки, пневмококки, нейссерии, гемофильные палочки, бациллярные формы. Особо следует обратить внимание на возможную этиологическую роль микобактерий, в том числе быстрорастущих, например M. fortuitum или ее комплекса.

С учетом тяжести заболевания и многообразия микроорганизмов, вызывающих данную патологию, выбор питательных сред должен быть достаточно широким и обеспечивать надежность бактериологического анализа. Схема выбора питательных сред при эндофтальмите представлена на рис. 157 [23, 54].

Рис. 157. Питательные среды для посева гнойного отделяемого при тяжелой патологии глаз [23].

Порядок забора проб для микробиологического исследования при эндофтальмите следующий. Проводит офтальмолог:

1. Увлажненным тампоном берут контрольные мазки с конъюнктивы. Забор проводят до анестезии. Для каждого глаза используют отдельный тампон.

2. Взятие пробы из пораженного глаза. Проводят забор аспирата внутриглазной жидкости (пункция, парацентез).

3. Если взятые пробы не передают сразу же микробиологу, их помещают в транспортные системы или проводят посев в транспортные среды, или на питательные среды общего назначения, готовят мазки на предметном стекле.

4. Пробы передают в микробиологическую лабораторию или хранят в рефрижераторе при 2-6°С в течение 2 часов. Посевы на культуральные питательные среды передают в микробиологическую лабораторию или помещают в термостат при 30-37 °С (чашки, перевернутые вверх дном).

5. Если объем аспирата недостаточен, непосредственно в шприц, которым сделан забор, можно добавить жидкой питательной среды сходного объема или в два раза большего.

Остальные манипуляции проводит только микробиолог.

Кератит. Поражение роговицы бывает бактериальной, грибной, вирусной и протозойной природы. Наиболее часто возникают кератиты бактериального и грибного происхождения. Основные возбудители: золотистые стафилококки, стрептококки, моракселлы (M. lacunata), пневмококки, палочки синезеленого гноя, серрации, быстрорастущие микобактерии, дрожжеподобные грибы рода Candida, аспергиллы, фузарии и некоторые другие.

С учетом многообразия микрофлоры посев проводят на питательные среды, аналогичные тем, что приведены для посева при эндофтальмите. Если состояние больного позволяет, важную информацию при выборе питательных сред может дать предварительно проведенная микроскопия мазков, окрашенных по Граму и Цилю-Нильсену. За рубежом практикуют окраску по Граму и краской Гимза.

Последовательность действий:

1. Забор контрольных проб с конъюнктивы обоих глаз (см. выше).

2. Тщательно обрабатывают антисептическим веществом кожу вокруг глаза.

3. Стерильным режущим предметом (скальпель, шпатель Kimura) делают соскобы (3-5) в местах ульцерации и гноетечения.

4. Проводят инокуляцию биоматериала в транспортные или культуральные среды, как указано выше. Наносят по одной капле на два предметных стекла и готовят мазки для последующей микроскопии.

5. Транспортировку и хранение осуществляют по приведенным выше рекомендациям.

6. Поскольку в некоторых случаях материала для посева и приготовления мазков бывает недостаточно, его объем можно увеличить, добавив несколько капель жидкой питательной среды.

Слезный аппарат

Наиболее частые возбудители дакриоаденита и дакриоцистита — стафилококки (обычно S. aureus), пневмококки, стрептококки (в том числе S. pyogenes), гемофильные палочки, палочки сине-зеленого гноя. При наличии соответствующих заболеваний иной локализации поражение может быть туберкулезной и гонококковой природы. Описаны кандидозные поражения (C. albicans').

К возбудителям каналикулита относятся стрептококки, моракселлы (M. la- cunata), пропионибактерии, анаэробные актиномицеты (A. israelii), дрожжеподобные грибы, аспергиллы. Для посева используют гнойное отделяемое. Берут тампоном мазки или собирают экссудат шприцом. При дакриоцистите, чтобы получить гной, слезный мешок пальпируют. При каналикулите для этого сжимают внутреннюю поверхность века.

Для сравнения результатов микробиологического исследования обязательно взятие мазков с конъюнктивы и их посев (контроль).

Рекомендуемые питательные среды: кровяной агар с 5% бараньей крови, шоколадный агар, среда Сабуро, жидкая обогащенная питательная среда для анаэробных бактерий, плотная среда для анаэробов. При наличии анамнестических и клинических данных целесообразно использовать гонококковую среду (шоколадный агар с активирующей добавкой).

При взятии гноя обязательно приготовление мазков для микроскопии. Окрашенные мазки исследуют в максимально короткие сроки для уточнения номенклатуры питательных сред и проведения по возможности адекватной химиотерапии.

Обеспечение качества микробиологических исследований:

1. Входной контроль качества всех компонентов микробиологического анализа, особо питательных сред, используемых для посева биосубстратов.

2. Тщательное соблюдение требований к транспорту и хранению биопроб.

3. Взятие и посев контрольных проб (обычно мазков с неповрежденной конъюнктивы).

4. Сравнение роста болезнетворных бактерий на различных питательных средах, учет их количественной характеристики.

5. Наблюдение за ростом микроорганизмов в динамике: традиционные возбудители гнойной патологии не менее 72 часов, грибов — 5-7 суток, микобактерий до 4-5 недель (быстрорастущих — до 7-10 суток).

6. Соблюдение всех требований к методике микробиологического исследования: посев, выделение, идентификация и тестирование чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (данные методики в этой работе из-за их объемности не рассматриваются).

После бактериологической диагностики второй важнейшей функцией микробиологической службы является определение чувствительности возбудителей инфекционной патологии глаз к антимикробным препаратам. В передовых клинических учреждениях микробиологические лаборатории вышли за рамки диагностических подразделений и стали равноправными участниками лечебного процесса именно в силу их высокой роли в выборе антибиотиков и их дозы для лечения больного.

Существуют три базовых метода определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным лекарственным средствам:

1) метод серийных разведений;

2) диск-диффузионный метод («метод дисков»);

3) сочетание метода серийных разведений с «методом дисков», так называемый Е-тест.

Диск-диффузионный метод наиболее часто используют в силу его относительной простоты и экономичности. Это фактически — качественный тест. Информация, которую он обеспечивает, носит ориентировочный характер, чревата ошибками (или по меньшей мере неточностями), в ряде случаев не является доступной. Диск-диффузионный метод не может быть использован в следующих случаях [7, 53].

1. Если культура не образует на поверхности агаризованной питательной среды равномерный, необходимой плотности микробный газон (например, многие слизеобразующие бациллы, грибы, микобактерии).

2. Если для образования микробного газона требуется более суток. Только в отдельных случаях (например, при определении чувствительности грибов к противогрибным препаратам) допустимо зонообразование в течение 48 часов.

3. Если микроорганизм требует особых условий инкубации, которые могут повлиять на размер и время образования зоны подавления роста (например, облигатно анаэробные бактерии).

4. Если микроб требует специальных питательных сред (облигатные анаэробы, микобактерии).

5. Если образуемая зона подавления роста не адекватна истинной чувствительности микроорганизма к антимикробному препарату (например, чувствительность «метициллинрезистентных» стафилококков к макролидам, аминогликозидам, тетрациклинам и др.).

Кроме того, при кажущейся простоте «метод дисков» чувствителен к качеству питательной среды и дисков, к точности соблюдения технологии постановки исследования. Возможность получения ошибочных результатов в этих случаях велика.

Метод серийных разведений предпочтителен прежде всего тем, что дает количественную характеристику чувствительности. Он более точен, поскольку первичен по отношению к «методу дисков» (размеры зон подавления роста это отражение МПК, минимальных подавляющих концентраций, которые определяют методом серийных разведений). Результаты, получаемые методом серийных разведений, позволяют корригировать дозу антимикробного препарата. Они в ряде ситуаций дают возможность расширить круг антибиотиков, целесообразных для лечения больного. Однако метод серийных разведений более трудоемок и менее экономичен, чем «метод дисков». Показаниями к использованию метода серийных разведений являются следующие [7, 46].

1. Тяжелые инфекции глаз, требующие наиболее взвешенного выбора антимикробного препарата и его дозы.

2. Необходимость получения количественной информации о чувствительности микроба к антибиотику (МПК). Особо высокую ценность этот показатель имеет при параллельном установлении фармакокинетики используемого антимикробного препарата.

3. Все случаи, когда диск-диффузионный метод не информативен (см. выше).

4. Потребность в референтных исследованиях. Речь идет не только о контроле качества исследования и его компонентов. Существуют клинические ситуации, когда установление устойчивости возбудителя «методом дисков» исключает применение наиболее эффективной группы антибиотических веществ. В этом случае данные, полученные методом серийных разведений, могут существенно повлиять на перспективу применения «неэффективного» препарата.

Метод серийных разведений в микробиологическом обеспечении лечения офтальмологических больных заслуживает более широкого применения. Это же относится и к умению использовать полученные данные в практике.

Техника определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам детально приведена в соответствующих методических публикациях [7, 46, 53]. Повторять их содержание нецелесообразно. Необходимо, однако, обратить внимание микробиологов на некоторые детали, особенно с учетом полиэтиологического характера офтальмологической патологии и отечественной практики.

1. Определять чувствительность к антибиотикам можно только при работе с чистой культурой. Все рекомендации использовать «смешанную культуру», «ассоциативный штамм» способны привести к серьезным ошибкам, лишают исследование важнейшего основания — строгой стандартизации.

2. Чувствительность микроорганизмов к антимикробным препаратам определяется только на специальных питательных средах, т. е. с использованием тех из них, которые были применены при разработке критериев чувствительности. Для диск-диффузионного метода — это среда АГВ и агар Мюллера—Хинтон, для метода серийных разведений — агар и бульон Мюллера—Хинтон. Есть несколько исключений, которые следует учитывать при определении чувствительности возбудителей инфекционных заболеваний глаз: чувствительность гонококков «методом дисков» определяют на гонококковом агаре, стрептококков (включая S.pneumoniae) — на агаре Мюллера—Хинтон с добавлением 5% бараньей крови, гемофильной палочки — на НТМ-агаре (вариант шоколадного агара). Свои особенности имеют питательные среды при определении чувствительности этих микроорганизмов методом серийных разведений.

3. Все питательные среды, используемые при определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, независимо от производителя и наличия паспортных данных должны проходить входной лабораторный контроль с использованием референс-штаммов (см. далее).

4. «Индикаторные» диски, т. е. диски с антибиотиками, можно использовать только при условии их выпуска по утвержденной государством технологии (при наличии паспорта с указанием номера ТУ — технических условий).

5. Диски чувствительны к воздействию влаги, нагревания, солнечных лучей. Их следует хранить в рефрижераторе при температуре не выше 8 °С, тщательно укупоренными. Не подвергать воздействию прямых солнечных лучей, не пользоваться влажным пинцетом, не держать флакон с дисками на столе открытым. В то же время перед использованием извлеченный из холодильника флакон с дисками следует выдержать при комнатной температуре не менее 1,5-2 часов, соблюдая указанные выше ограничения.

6. Приведенный в методических пособиях порядок проведения исследования (технология исследования) должен неукоснительно соблюдаться. Отклонения от требований к приготовлению и использованию инокулюма, приготовлению чашек с питательной средой, к подготовке и использованию дисков, к инкубации приводят к серьезным ошибкам.

7. Не определять чувствительность к антибиотикам тех микроорганизмов, для которых не разработаны общепризнанные критерии чувствительности.

8. Обязателен контроль качества определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, который в зависимости от количества выпадающих значений может быть ежедневным или еженедельным. Для проведения контрольных исследований в каждой микробиологической лаборатории должны быть референс-штаммы:

♦ Escherichia coli ATCC 25922.

♦ Staphylococcus aureus ATCC 25923.

♦ Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

♦ Escherichia coli ATCC 35218.

♦ Enterococcus faecalis ATCC 29212.

В практических лабораториях медицинских учреждений (кроме научноисследовательских) замена этих штаммов на иные категорически не рекомендуется.